番茄碱的制备及其对乙酰胆碱酯酶的抑制作用

姜晓霞，朱艳雯，周丽丽，赵 楠，刘 玲，岳喜庆，白 冰*

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

甾体生物碱主要分布于夹竹桃科、天牛科、茄科和百合科植物中，是植物的自我防御代谢产物。番茄中的甾体生物碱成分主要是番茄碱，其含量在番茄叶、花、茎、青果中依次降低[1]。番茄碱是一种具有抗菌[2-3]、抗病毒[4-5]、抗炎[6-7]、抗癌[8-10]等多种生理功能的活性分子[11]。

在胆碱能体系中，乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）能将神经递质乙酰胆碱水解为乙酸和胆碱。AChE的过度激活可降低突触中的乙酰胆碱水平，导致阿尔茨海默症等神经系统疾病的发生[12]。因此抑制AChE活性和上调乙酰胆碱水平是维持胆碱能系统平衡的关键。已有研究初步揭示了番茄碱的神经保护作用，如番茄碱能通过保护线粒体膜电位和抑制氧化应激的方式降低谷氨酸盐对SH-SY5Y神经母细胞瘤的毒性，从而保护神经[13]。另外，番茄碱还可以增加溶酶体活性，进而对缺血性神经损伤发挥保护作用[14]。番茄碱来源于食品，毒性低，通过番茄碱与AChE的相互作用探索番茄碱神经保护活性的研究相对较少。本实验从番茄叶中制备出番茄碱，利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（ultra-performance liquid chromatographyquadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLCQTOF-MS）、核磁共振（nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）对产物的结构进行鉴定并与标准品比对；利用紫外光谱法检测番茄碱对AChE活性的影响；以分子荧光光度法及3D、2D分子对接技术进一步揭示番茄碱与AChE相互作用方式，从而为番茄碱的神经保护机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

番茄叶于2019年9月采自沈阳农业大学番茄种植基地。

番茄碱、茄碱 北京索莱宝公司；AChE（来源于电鳗） 美国Sigma-Aldrich公司；碘化硫代乙酰胆碱、5,5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）；其他试剂均为分析纯 大连美仑生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

XD-52AA旋转蒸发仪 上海贤德公司；5430R高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司；FD5-3P冷冻干燥机 美国SIM公司；UPLC-TOF-MS仪 美国Waters公司；AVANCE III 600 MHz NMR仪 德国Bruker公司；TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析通用公司；F-4600荧光光谱仪 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 番茄碱粗提物的制备

番茄碱提取方法参照文献[15-16]。取烘干（70 ℃、8 h）并磨粉过筛（80 目）的番茄叶粉50.0 g，按一定料液比加入体积分数70%甲醇溶液，超声提取后抽滤。滤液旋转蒸发浓缩至约10 mL，再加入体积分数5% HCl溶液调pH值至2～3，加入等体积的无水乙醚萃取，经萃取的溶液用浓氨水调pH值至10～11，冷冻离心30 min（10 000 r/min），沉淀继续重复此酸溶碱沉操作3 次，得到的沉淀即为番茄碱粗提物。番茄碱提取量按式（1）计算。

1.3.2 单因素试验

考察超声条件中的料液比（m（番茄叶粉）∶V（体积分数70%甲醇溶液））（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）、超声时间（20、30、40、50、60 min）、超声温度（25、30、35、40、45 ℃）和pH值（8、9、10、11、12）4 个因素对番茄碱提取量的影响。做单因素试验时，各固定因素分别为：料液比1∶15、超声时间40 min、超声温度35 ℃、pH 10。

1.3.3 响应面试验

以料液比（A）、超声时间（B）、超声温度（C）和pH值（D）设计四因素三水平试验，具体见表1。通过Design Expert 8.0.6软件对结果进行分析。

表1 响应面试验因素及水平Table 1 Level and code of independent variables used for response surface design

1.3.4 番茄碱的纯化

番茄碱的纯化步骤参照文献[1]，番茄碱粗提物经Al2O3柱层析后收集目标组分，冻干得到褐色粉末，于-20 ℃保存。

1.3.5 UPLC-QTOF-MS和1H NMR、13C NMR鉴定纯化后的番茄碱样品

参照文献[17]采用UPLC-QTOF-MS鉴定番茄碱，纯化后的番茄碱样品溶于甲醇配制成质量浓度为50 μg/L的溶液，过0.22 μm滤膜后进样。

UPLC条件：ACQUITY UPLC C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，5 μm）；流动相：A相为0.1%甲酸，B相为甲醇；流速0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量1 μL；检测波长205 nm。梯度洗脱色谱条件：0～0.2 min，90% A；0.2～6.0 min，流动相A体积分数递减至10%；6～8 min，10% A；8.0～8.1 min，流动相A体积分数递增至90%；8.1～10.0 min，90% A。

MS条件：电喷雾离子源正离子扫描模式；毛细管电压3 500 V；干燥气温度345 ℃；干燥气体积流量3.0 L/min；脱溶剂温度350 ℃；扫描范围m/z100～1 200；二级裂解电压20～45 eV。

NMR鉴定番茄碱：纯化后的番茄碱样品经氘代二甲基亚砜（dimethylsulphoxide，DMSO-d6）溶解配制成10 mg/mL的溶液，进行NMR测定，采用MestReNova软件分析结果。此部分实验委托沈阳药科大学药学院测试中心进行。

1.3.6 AChE活力测定及分子荧光光谱检测

pH 7.0磷酸缓冲溶液（0.01 mol/L）配制所有试剂。将0.1 mg/mL AChE分别以体积比1∶1与0.25～1.00 mmol/L浓度范围番茄碱或者0.6～1.0 mmol/L茄碱混合，37 ℃水浴20 min，作为酶处理液，同时以未作任何处理的0.1 mg/mL AChE溶液作对照。

AChE活力测定检测参考文献[18]。测定3 mL反应体系（2.7 mL磷酸缓冲液、0.l mL 2.5 mmol/L碘化硫代乙酰胆碱、0.l mL 3 mmol/L DTNB溶液及50 μL酶处理液），于412 nm波长处每10 s记录吸光度，共检测5 min，每组平行测定3 次。

分子荧光光谱检测：酶处理液在激发波长280 nm下检测发射波长300～700 nm处荧光光谱。番茄碱和茄碱本身无荧光效应，不产生干扰。

1.3.7 酶抑制动力学分析

酶抑制动力学是通过酶催化反应速率的变化规律来研究抑制剂对酶作用的机理[19]，Lineweaver-Burk双倒数作图基于米氏方程（式（2））。

式中：V0表示反应初始速率/（mmol/（L·s））；Vm表示最大反应速率/（mmol/（L·s））；[S]表示为底物浓度/（mmol/L）；Km表示米氏常数。

以1/[S]为横坐标，以1/V0为纵坐标建立一条一次函数直线，其中横坐标截距绝对值的倒数为Km，纵坐标截距的倒数则为Vm。

通过研究抑制剂对酶的Km和Vm的影响，可以确定抑制剂的抑制类型。当Km增大，Vm不变，双倒数曲线相交于纵坐标时，该抑制类型为竞争性抑制；当Km不变，Vm减小，双倒数曲线相交于横坐标时，该抑制类型为非竞争性抑制；当Km减小，Vm下降，Vm/Km不变，双倒数曲线相互平行时，即该抑制类型为反竞争性抑制。

1.3.8 分子对接分析

番茄碱的立体结构利用Chem3D Ultra 14.0软件得到，乙酰胆碱酯酶的立体结构利用Protein Data Bank得到的。3D分子对接使用Auto Dock程序完成，2D分子对接使用LigPlot程序完成[20]。

1.4 数据统计与处理

数据统计分析采用Design Expert 8.0.6、MestReNova软件，作图采用OriginPro 8.0软件。

2 结果与分析

2.1 番茄碱的提取量

2.1.1 单因素试验结果

如图1所示，随料液比降低、超声时间延长、超声温度升高、pH值增加，番茄碱提取量均先增加后降低，当料液比1∶20、超声时间40 min、超声温度40 ℃、pH值为11时，番茄碱提取量最高。

图1 不同因素对番茄碱提取量的影响Fig.1 Effects of variables on the extraction yield of tomatidine from tomato leaves

2.1.2 响应面试验结果

以料液比（A）、超声时间（B）、超声温度（C）及pH值（D）为自变量，以番茄碱提取量为响应值，设计响应面试验，结果见表2，再采用Design Expert 8.0.6软件对结果进行分析，得到表3和图2。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Experimental results of response surface design

对表2的结果进行多元回归模拟，得到番茄碱提取量/（mg/100 g）＝23.22-0.10A+0.16B+0.63C-0.53D-0.31AB-0.25AC-0.22AD-0.085BC+0.42BD-0.35CD-0.64A2-0.97B2-1.30C2-0.73D2。如表3、图2所示，一次项B影响显著（P＜0.05），C、D影响极显著（P＜0.01），A影响不显著。交互项A×B、C×D影响显著；B×D影响极显著；A×C、A×D和B×C影响不显著；二次项A2、B2、C2和D2均有极显著影响。说明料液比、超声时间、超声温度、pH值对番茄碱提取量的影响并非简单的线性关系，存在复杂的交错影响。综合对比，影响效果由高到低顺序为C（超声温度）＞D（pH值）＞B（超声时间）＞A（料液比）。

图2 不同因素的交互作用对番茄碱提取量的影响Fig.2 Response surface and contour plots showing interactive effects of variables on tomatidine extracts

表3 回归方程方差分析结果Table 3 Analysis of variance of regression model

2.1.3 优化最佳工艺参数及验证结果

依据响应面分析，当料液比1∶19.67、超声时间39.85 min、超声温度41.54 ℃、pH值为10.56时，番茄碱的提取量为23.437 6 mg/100 g。工艺参数调整为：料液比1∶20、超声时间40 min、超声温度40 ℃、pH 11。采用调整后的工艺参数，3 次提取番茄碱量平均值为23.19 mg/100 g，说明响应面优化结果准确。

2.2 番茄碱纯化产物的UPLC-QTOF-MS分析

如图3所示，经UPLC-QTOF-MS分析，纯化后的产物保留时间为10.0 min，其[M+H]+m/z为416.267 6，比对标准品质谱数据，确定产物为番茄碱（C27H45NO2，m/z415.65）。并用番茄碱标准品作标准曲线，对样品进行定量分析，测得纯度约为90%。m/z398.260 3、m/z273.164 7和m/z255.157 7均由[M+H]+m/z416.267 6裂解而来。m/z398.260 3是由[M+H]+m/z416.267 6脱水形成；m/z273.164 7是由[M+H]+m/z416.267 6环碎裂产生的；m/z255.157 7是由m/z273.164 7进一步失水得到的[21]。以上结果可进一步证明纯化后的产物为番茄碱。

图3 番茄碱的UPLC-QTOF-MS解析Fig.3 Analysis of tomatidine by UPLC-QTOF-MS

2.3 NMR结果分析

采用NMR法对纯化后的产物进行进一步鉴定，结果如图4所示。对1H和13C进行标峰，并对峰面积进行积分，通过化学位移和积分面积确定氢原子和碳原子的位置及数量，具体分析结果见表4。该化合物共含有45 个氢原子和27 个碳原子，与番茄碱的结构相吻合，因此确定该化合物为番茄碱。

表4 纯化后产物1H NMR和13C NMR的数据归属（DMSO，600 MHz）Table 4 1H NMR and 13C NMR data assignment of the purified product(DMSO, 600 MHz)

图4 纯化后产物的1H NMR（A）和13C NMR（B）谱图（600 MHz，DMSO）Fig.4 1H NMR (A) and 13C NMR (B) spectra of the purified product(600 MHz, DMSO)

2.4 番茄碱对乙酰胆碱酯酶活性的影响及其酶动力学分析结果

由图5A、B可知，番茄碱（0.125～0.5 mmol/L）和茄碱（0.3～0.5 mmol/L）在相应的浓度范围内对AChE活性均有抑制效果，且存在浓度依赖关系；该现象与Jiang Bo等[22]报道的骆驼蓬中的去氢骆驼蓬碱和骆驼蓬碱能够抑制正常大鼠脑内AChE活性的结论相一致。利用Lineweaver-Burk双倒数作图法进行酶动力学分析（图5C、D），随着番茄碱、茄碱浓度的增大，均有Vm不变、Km增大的现象，说明番茄碱、茄碱对AChE的抑制均为竞争性抑制。

图5 番茄碱、茄碱对AChE活力的影响Fig.5 Effects of tomatidine and solanine on the activity of AChE

2.5 分子荧光光谱和分子对接解析番茄碱与乙酰胆碱酯酶的相互作用

AChE中色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）具有内源性荧光特性，其荧光强度比为100∶9∶0.5[23-24]。如图6A、B所示，AChE在激发波长为280 nm处，荧光发射波长约为340 nm。添加番茄碱后，340 nm处荧光强度降低，并且随着番茄碱浓度增加，出现明显的红移现象，荧光发射波长由340 nm转移至378 nm（番茄碱浓度0.25 mmol/L）和390 nm（番茄碱浓度0.5 mmol/L）处。推测带苯环的氨基酸可能与番茄碱发生了相互作用，通过形成氢键或者形成疏水相互作用的方式，导致蛋白部分解折叠，弱化了340 nm波长处的荧光强度并使其红移。与番茄碱不同，茄碱仅降低了AChE的荧光强度，并没有出现明显的红移现象。

如图6C所示，经3D分子对接分析，番茄碱会与AChE的催化活性中心的Trp86产生一个氢键，距离为2.6 Å。而Trp86正是AChE与底物胆碱的结合位点，也就是说，番茄碱是通过与AChE蛋白上底物结合位点中Trp86形成氢键的方式，竞争性地干扰了AChE与底物乙酰胆碱的结合，从而部分抑制AChE的催化活性。如图6D所示，利用2D分子对接技术，发现番茄碱与AChE蛋白中的Ser293、Phe295、Phe338、Phe297、Ser125、Gly121、Ser203、Glu202、Gly120、His447、Gly448、Ile451、Trp86、Tyr124、Tyr337、Tyr341、Ile294可以形成疏水相互作用，这些新生成的疏水作用改变了AChE周围的微环境，也进一步解释了番茄碱是通过形成疏水相互作用的方式弱化AChE蛋白在340 nm波长处的荧光强度并使其红移。综上，番茄碱主要通过与AChE蛋白上底物结合位点部分氨基酸残基形成氢键和疏水相互作用的方式起到部分抑制AChE活性的目的。

3 结 论

本研究采用超声波提取法提取番茄叶中的番茄碱，通过UPLC-QTOF-MS和NMR法鉴定纯化后的产物为番茄碱，采用紫外光谱法和酶动力学分析发现番茄叶中提取的番茄碱具有部分抑制AChE活性，且其抑制类型为竞争性抑制。2D、3D分子对接技术阐明番茄碱是通过与AChE蛋白Trp86形成氢键方式，同时与多个疏水氨基酸形成疏水相互作用，竞争性地干扰了AChE与底物的结合，说明形成氢键与疏水相互作用为番茄碱抑制AChE活性的主要方式。