从普通母猪中生产高质量实验用猪生产技术的探讨*

华利忠 王海燕 冯志新 王 佳 袁 厅 甘 源 张 磊 邵国青

(1.江苏省农业科学院兽医研究所 农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，南京 210014)(2.江苏农林职业技术学院，镇江 212400)

SPF(specific pathogen free)猪即无特定病原猪, 其特殊价值在于：无主要的传染病、无垂直传染性疾病、无人猪共患病、无对实验研究可能产生干扰的微生物[1]，不仅在畜牧兽医生产实践中发挥着重要作用，也是生命科学研究、生物制品生产的重要实验材料和原材料，其质量好坏直接关系到上述多方面研究成果的可靠性及准确性[2],是高质量实验用猪。我国的SPF猪按国家标准GB 22914—2008-T指应无猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)、猪肺炎支原体(mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)、猪胸膜肺炎放线杆菌(actinobacillus pleuropneumoniae,APP)、猪产毒素多杀性巴氏杆菌(Toxigenic pasteurella multocida，T+Pm)、流行性乙型脑炎病毒(japanese encephalitis virus,JEV)等共12种病原，且临床检测没有猪口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)、非洲猪瘟(African swine fever,ASF)等15种病的猪。由于我国SPF猪的供应还没有产业化，数量有限，随着生物医药和医学的发展，特别是2018年非洲猪瘟传入我国后[3]，我国高质量实验用猪的缺口也越来越大。如何批量生产能够在一定程度上替代SPF猪的高质量实验用猪，是促进我国生物医药及医学领域发展的重要基础条件。本研究通过供体母猪的管理，无菌接产方式和人工饲喂标准以及人工乳配方的优化等方式，初步尝试了一种以普通母猪为供体，分娩高质量实验用仔猪的方法，成功获得了猪主要疫病均为阴性的高质量实验用猪，该方法的应用推广，可批量提供高质量实验用猪，弥补国内实验用猪的缺口。

1 材料和方法

1.1 妊娠母猪选择及处理

本实验分两批动物进行，均选择3～5胎次临床健康经产母猪。实验一为2头二花脸母猪和2头大白猪，实验二为5头长大二元母猪。上述母猪经检测均为PRRSV、PRV、PCV2以及Mhp阳性母猪。上述母猪在前一次分娩14 d后肌肉注射PRRSV减毒活疫苗，21 d断奶后隔离环境下封群饲养，并采用对应的精液(二花脸×二花脸；大白猪×大白猪；长大二元母猪×杜洛克公猪)人工授精。封闭饲养后第20天肌肉注射猪伪狂犬基因缺失苗，50 d后肌肉注射猪瘟兔化弱毒疫苗1次，分娩前1月肌肉注射猪圆环灭活苗1次。分娩前20 d拌料给药：80%泰妙菌素250 g/t+15%金霉素2 000 g/t+电解多维400 g/t，连用2周。

1.2 人工乳

人工乳为江苏省农业科学院兽医研究所自配奶粉，配方奶主要成分和含量见表1，并采用放射性同位素钴60射线源辐照灭菌，辐照剂量为20 KGy。

表1 新生仔猪人工乳配方

1.3 主要试剂

CSFV抗体ELISA检测试剂盒、PRRSV抗体ELISA检测试剂盒、猪伪狂犬gE蛋白(pseudorabies virus gE protein,PRV gE)抗体ELISA检测试剂盒和Mhp抗体ELISA检测试剂盒(爱德士生物科技公司)；Trizol Reagent(Invitrogen公司)和Taq酶(TaKaRa公司)。

1.4 实验设计

本实验分两次动物实验进行。实验一：人工乳和市售婴儿奶粉饲养无菌接产猪对比实验。无菌接产2头二花脸母猪和2头大白母猪，分娩时采用无菌接产方式接产仔猪，然后在隔离环境下人工饲喂，并随机分为两组。实验组饲喂自配人工乳，对照组饲喂市售普通1段婴儿奶粉。实验二：人工乳饲喂和母猪自养(母乳饲养)对比实验。隔离饲养的5头二元母猪，每头无菌接产5头三元仔猪(无菌接产的仔猪选择第1、3、5、7、9头出生仔猪)，隔离环境下采用人工乳人工喂养。剩余仔猪由母猪自繁自养。

1.5 无菌接产程序

母猪有分娩症状时采用聚维酮碘全身消毒，并在母猪后驱铺上灭菌垫子。分娩时，接产人员穿上无菌工作服，消毒双手后带上无菌手套准备接生。每接生一头消毒一次。仔猪出生后立即放入37～40 ℃预热的聚维酮碘内，同时用无菌毛巾擦拭口中及体表黏液，断脐，再转入37 ℃保温运输箱内，迅速运至另一隔离间的屏障系统内。

1.6 仔猪的饲养管理

人工饲喂的仔猪，分别用对应的人工乳和市售奶粉进行饲养。饲喂方法：取1份人工乳(或奶粉)，加入7份40～45 ℃灭菌蒸馏水中，充分混匀后奶瓶饲喂。饲喂频率及环境温度根据仔猪日龄调整(表2)。其中1～7日龄，全部饲喂流质的人工乳或奶粉，7日龄后统一逐步添加经放射性同位素钴60辐照过的仔猪教槽料，直到21日龄断奶，全部改为教槽料。实验二中自繁自养的仔猪同样在7日龄时开始教槽，21日龄断奶，断奶后母子分离，仔猪隔离饲养，饲养条件等同实验组。

表2 各日龄阶段仔猪人工饲喂次数及温度控制

1.7 临床症状观察、体质量测定及存活率统计

每天观察所有仔猪的临床症状，记录。分别于21日龄和2月龄统计各实验组的存活率。新生仔猪在接产后立即进行初生重测定，并于21日龄断奶时测定其断奶重，并对比日增重差异。

1.8 病原及抗体的检测

新生仔猪在21日龄断奶时根据NY/T 541规定的方法进行血样、鼻拭子、扁桃体样以及粪便样品的采集。其中血清样本进行PRRSV、CFSV、PRVgE、PCV2、FMD和Mhp的抗体检测以及PRRSV和PCV2病原检测；鼻拭子进行Mhp、APP以及T+Pm的病原检测；扁桃体进行CSFV和PRVgE的病原检测；粪便进行PEDV和TGEV的病原检测。

2 结果

2.1 无菌接产仔猪数量及分组情况

无菌接产情况，实验分组及数量见表3。其中实验一 一共无菌接产二花脸仔猪18头以及纯种大白仔猪19头，所有仔猪在隔离环境下人工饲喂，并分为两组。实验组为8头二花脸和10头大白猪，饲喂自配人工乳，对照组为10头二花脸和9头大白猪，饲喂市售普通1段婴儿奶粉。实验二共分娩59头仔猪，每窝按计划无菌接产5头三元仔猪，共25头，作为实验组，饲喂人工乳，其余猪(34头)作为对照组由母猪自繁自养。

表3 各个实验组仔猪数量及饲喂配方

2.2 临床观察及存活率统计

在实验一中，对照组猪在2日龄时就出现了水样腹泻，黄色，5 d内扩散到全组，腹泻率达到100%，迅速消瘦脱水，其中大白猪首例死亡出现在4日龄，二花脸猪首例死亡出现在6日龄。实验组猪在3日龄开始出现一过性腹泻，黄色，并在5～6日龄后恢复，腹泻数大白猪4头，二花脸猪3头。实验组和对照组在21日龄和2月龄的存活率统计见表3。由表3显示实验组仔猪100%存活，而对照组仅存活10%左右。

实验二的腹泻数和存活率统计见表4。由表4发现实验组中出现腹泻的数量每窝在1～3头不等，但很快好转，存活率达到了100%。而对照组仅1窝出现了2头腹泻，另1窝淘汰了1头弱仔外，没有出现其他异常，存活率几乎也达到了100%。

表4 实验猪腹泻数及21日龄存活率统计

2.3 体质量变化

由于实验一的对照组死亡较多，体质量统计对比没有意义。在本实验中，仅统计了实验二的体质量数据，结果见表5。由表5发现，对照组和实验组的平均初生重一致，分别为1.66和1.63 kg，但断奶重差别较大，分别为5.05和7.48 kg，差异有统计学意义(P<0.05)。实验组和对照组的日增重分别为0.16和0.28 kg/d，差异有统计学意义(P<0.05)。

表5 实验二中实验猪体质量和日增重

2.4 抗体检测

实验一所有的猪，所有检测的抗体指标均为阴性。而实验二中，所有实验组的抗体指标均为阴性，但对照组断奶猪PRRSV、CSFV、PRVgE、PCV2、FMD和Mhp的抗体阳性率分别为63.6%、84.8%、100%、100%、100%以及90.9%(表6)。

表6 实验二抗体检测结果

2.5 断奶猪病原检测

实验一实验组和对照组共20头断奶猪，经检测PRRSV、PCV2、CSFV、PRV、Mhp、APP、T+Pm、PEDV和TGEV全为阴性。而实验二中实验组上述指标也全是阴性，但在对照组的33头断奶仔猪中分别检测出了2头PRRSV阳性，25头PCV2阳性，18头Mhp阳性以及1头PEDV阳性(表7)。

表7 实验二病原检测结果

3 讨论

SPF猪一般采用外科手术法获取，其理论依据是：绝大多数猪病不能通过胎盘传染给胎儿，手术法取胎后隔离器饲养人工饲喂仔猪可防止病原的水平传播。然该技术对供体母猪要求高，操作相对复杂、生产成本较高、不易推广普及，所以很多研究转向利用自然分娩法培育SPF猪，原理同手术法。丹麦、日本和台湾也采用此法获取初级SPF猪，并建立了SPF猪群。通过自然分娩，但不吃初乳(snatch-farrowed, porcine-colostrum-deprived, SF-pCD)仔猪的培育，获得了高质量的实验用猪，并将其用于疾病模型的建立[4-5]。有研究[6]也做了初步的尝试，净化了PRV、弓形体以及PRRSV等多种病原。此外，胚胎移植技术也能生产SPF猪。其主要步骤是：无菌环境下回收胚胎，将胚胎用含有双抗和抗真菌的新鲜培养基清洗后进行移植，再通过无菌接产和隔离器饲养，可达到培育SPF猪的目的。有研究[7]利用这个技术成功培育了SPF五指山猪。但这个技术要求更高，也无法大面积推广。

除SPF猪规定的病原外，PCV2的存在也会对实验造成影响，但去除PCV2相对困难。有研究采用屏障系统[8]，剖宫产和无菌接产技术培育了PCV阴性仔猪，但也存在转阳的情况。哈尔滨兽医研究所已建立了该套技术体系，利用该技术从CSFV、FMD、PRRSV、JE、PRV、PCV2、PPV等阳性母猪中接生到了全部为阴性的仔猪[2]。但是该技术并不能保证百分百可以剔除垂直传播病原。本研究用普通母猪作为供体，在没有剖宫产和手术取胚的情况下，通过无菌接产，隔离器饲养等多方面进行病原控制，也达到了培育PRRSV、CSFV、PRV、PCV2等多种猪主要疫病病原全阴性实验用猪的目的。该方法主要原理和上述方法一致，但供体母猪广泛，操作相对简单，容易推广。该方法相对剖宫产技术的主要风险在于阻断垂直传播更为困难。所以在实施无菌接产之前，对母猪的管理尤为重要，本实验通过选取3～5胎次的临床健康经产母猪为供体，实施封群和疫苗免疫，其目的就是尽可能的阻断病原的垂直传播，再通过无菌接产，屏障系统等措施，阻断水平传播，以达到净化相关病原的目的。但由于本实验涉及的母猪数仅9头，数量不多，目前还不能得出该技术能100%成功的结论，所以，在批量生产时，需建立小单元的屏障系统，以减少仔猪在饲养过程中，部分病原大面积转阳的风险。

在人工饲喂过程中，腹泻是仔猪存活率的一大风险。腹泻的主要因素有仔猪胃肠道的发育不全、人工乳的营养以及大肠杆菌等。本研究优化了人工乳的配方，提供了相对全面的营养以及多种抗腹泻和提高免疫力的原料，大大降低了仔猪的腹泻率，这也是保证本实验所培育的仔猪存活率大大提高的原因之一。在体质量方面，相比母猪自繁自养的仔猪，人工培育的仔猪体质量相对较轻，那是人工喂养时由于劳动力等因素，仔猪采食的频率没有自繁自养的高，再加上少数几头猪一过性的腹泻，对日增重有所影响。而由于每窝移走了5头仔猪，母猪自带的仔猪相对较少，所能获得的母乳相对充足，又未发生腹泻等疾病，故日增重相对较大。

通过供体母猪的管理，无菌接产，人工乳的优化，屏障系统内人工喂养的系列措施，可实现以普通母猪为供体，培育出猪主要疫病均为阴性的高质量实验用猪。该方法可在没有现成SPF母猪的前提下，建立了一种科学、有效、简便的高质量实验用猪的生产技术，为我国优质实验动物的产业化提供了临床经验和理论依据。