大柴胡汤治疗结石性胆囊炎的网络药理学研究及分子对接验证

张涛 周春宇 杨成城 张少辉 门斯烨 钱嘉惠 马亦湘 安佳琳

摘要 目的：基于网络药理学和分子对接的方法探讨大柴胡汤治疗胆囊炎（Cholecystitis）的作用机制。方法：通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）检索相关文献获得大柴胡汤所含中药的主要化学成分，收集其相对应的靶点;胆囊炎疾病靶点来源于GeneCards、在线人类孟德尔遗传（OMIM）、PharmGkb数据库。结合Cytoscape 3.8.0构建药物-核心靶点-有效成分网络、靶标蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。利用Bioconductor中的R包对核心靶标进行基因本体（GO）富集和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。结果：获得大柴胡汤活性成分151个，药物靶点260个;疾病靶点485个;交集基因55个;PPI网络分析发现，核心蛋白涉及TNF-α、CCK、EGFR、AKT1、VEGFA;GO富集分析得到2 307个GO条目。大柴胡汤包含细胞组分92个，生物过程2 126个，分子功能89个，主要有受体配体活性、细胞因子活性、細胞因子受体结合、磷酸酶结合等;KEGG通路富集分析发现大柴胡汤主要涉及AGE-RAGE信号通路、白细胞介素-17信号通路以及HIF-1信号通路等。结论：通过网络药理学分析发现，大柴胡汤多成分、多靶点调控机体，通过多途径起到治疗结石性胆囊炎的作用。

关键词 大柴胡汤;胆囊炎;网络药理学;靶点;蛋白;信号通路;分子对接

Abstract Objective：To explore the mechanism of Dachaihu Decoction in the treatment of cholecystitis based on network pharmacology and molecular docking.Methods：the main chemical constituents of Dachaihu Decoction were obtained from TCMSP and related literature，and the corresponding targets were collected; the targets of cholecystitis were from GeneCards，OMIM and PharmGKB databases.Combined with Cytoscape 3.8.0，the drug core target active component network was constructed，and the target protein interacted with PPI network.The r-packet of Bioconductor was used to enrich go and analyze KEGG pathway.Results：A total of 151 active components and 260 drug targets of Dachaihu Decoction were obtained; 485 disease targets were obtained; 55 intersection genes were obtained; PPI protein network analysis showed that core proteins involved TNF-α，CCK，EGFR，AKT1，VEGFA; and 2 307 go entries were enriched in go.There were 92 cell components，2 126 biological processes and 89 molecular functions，mainly including receptor ligand activity，cytokine activity，cytokine receptor binding，phosphatase binding，etc.; KEGG pathway enrichment analysis found that it mainly involved age-rage signaling pathway，interleukin-17 signaling pathway and HIF-1 signaling pathway.Conclusion：through the analysis of network pharmacology，Dachaihu Decoction has the effect of treating calculous cholecystitis by multi-component and multi-target regulation.

Keywords Dachaihu Decoction; Cholecystitis; Network pharmacology; Target; Protein; Signal pathway; Molecular docking

中图分类号：R285文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.01.011

随着人们生活水平的不断提高，结石性胆囊炎的发病也逐渐呈上升趋势。据报道胆囊结石的患病率为10%～15%，且有逐年升高的趋势。手术切除胆囊一直是治疗本病的根本措施。手术虽有根治作用，但是由于术后体内产生胆石的微环境并未改变，术后胆石复发率仍居高不下，难免存在诸多后遗症，如胆管残留结石、胆漏、胆管扩张、肝外胆管损伤等，不易被患者接受。

中医认为结石性胆囊炎当属于中医学“胁痛”“胆胀”“黄疸”等范畴，认为其与肝胆气郁有密切关系。以大柴胡汤为代表的处方治疗结石性胆囊炎取得了良好的临床疗效。在实验研究中，大柴胡汤的药理学研究也相对成熟。但是当前针对大柴胡汤治疗结石性胆囊炎的作用机制研究尚未清楚。故我们基于网络药理学的研究方法探讨大柴胡汤治疗结石性胆囊炎的治疗机制。

1 材料与方法

1.1 大柴胡汤药物化学成分收集及药物靶点预测

登录中药系统网络药理学数据库与分析平台（TCMSP）[1]（网址http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）。数据库（Database）选择TCMSPTM，设置搜索条目为Herb name。为筛选大柴胡汤的有效化学成分（Ingredients），在搜索条目下分别输入大柴胡汤的药物组成：柴胡、黄芩、大黄、枳实、半夏、白芍、生姜、大枣。设置筛选条件为口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18[2]。完整复制各中药符合筛选条件的所有Ingredients于文本文档中。为筛选大柴胡汤各中药目标靶点（Targets Information），在输入界面选择Related Targets，完整复制各中药符合筛选条件的所有Targets information于文本文档中。因甘草为佐使药，所含有效化学成分多且复杂，为保证真实有效性，按OB≥60%筛选有效化学成分及靶点。数据库所获得的药物有效化学成分及靶点信息应用Drugbank[3]（https：//www.drugbank.ca/）使其格式标准化。

1.2 疾病靶点来源

登录GeneCards人类基因数据库[4]（网址https：//www.genecards.org/）、在线人类孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，网址https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）数据库[5]、国际遗传药理学数据库（PharmGkb）（网址https：//www.pharmgkb.org），设置搜索条目为关键词搜索。搜索条目下以“Cholecystitis、Calculous cholecystitis”为关键词筛选，设置物种为人，获取结石性胆囊炎相关的疾病靶点。对3个数据库检索到的疾病靶点进行合并去重，作为最终的疾病靶点来源。

1.3 获取交集基因与化学成分-靶点网络图的构建

选择R软件，安装Draw Venn Diagrams程辑包，运行以获得交集基因靶点作为大柴胡汤治疗结石性胆囊炎的潜在作用靶点并绘制韦恩图。将获取到的交集基因导入网络可视化软件Cytoscape 3.8.0，构建化学成分-靶点作用网络。对网络进行分析，以度值参数作为评价节点在网络中重要性的标准。

1.4 大柴胡汤治疗结石性胆囊炎的蛋白质-蛋白质相互作用网络构建及核心蛋白筛选

人类生命体蛋白质之间存在着相互作用的直接或间接联系。为观察大柴胡汤治疗结石性胆囊炎的蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）以及筛选核心蛋白，登录String数据库（网址https：//string-db.org/），选择Multiple proteins，在搜索条目下输入获取到的交集基因，限定物种为Homo Sapiens，其余设置保持不变，构建PPI功能网络，并绘制网络图。为筛选核心蛋白，将STRING数据库得到的string_interactions.txt文件导入Cytoscape 3.8.0，应用Network Analyse插件构建网络，选择CytoNCA插件进行网络拓扑分析，筛选网络中的关键节点。核心蛋白筛选参数：Betweenness Centrality，Closeness Centrality，Degree Centrality，Eigenvector Centrality，Local Average Connectivity-based method。筛选条件：应用R软件的在线程辑包，对交集基因下的Betweennes Centrality、Closeness Centrality、Degree Centrality、Eigenvector Centrality、Local Average Connectivity-based method数值进行测算，各组数值中大于本组中位值的基因予以保留，运行2次R脚本，筛选核心蛋白基因。应用CytoHubba插件计算构建的网络的Betweennes、Closeness、Degree、Eigenvector、LAC数值，并对计算过的数值基因进行可视化处理。

1.5 基因本体和京都基因与基因组百科全书通路富集分析

基于R语言对获取到的交集基因进行富集分析。在R语言中Bioconductor（https：//www.bioconductor.org/）网站安装所需要的Biocmanager，org.Hs.eg.db，Colorspace，Stringi，ggplot2，DOSE，ClusterProfiler，enrichplot，Pathview等程辑包。首先将基因Symbol转化为基因ID，选擇物种为人（Homo spanies），设定阈值为P<0.05，输出基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集结果并绘制条形图与气泡图。

1.6 分子对接验证

登录Pubchem数据库（http：//zinc.docking.org/）查询“1.3”中大柴胡汤关键成分结构，保存格式选择为mol并优化结构。登录PDB蛋白质结构数据库（http：//www.rcsb.org/），搜索“1.4”中筛选出的核心交集基因蛋白，下载核心蛋白的3D结构，保存格式选择PDB。使用PyMol软件删除蛋白质结构的水分子和小分子配体，并导入AutoDockTools进行加氢等预处理，将有效成分和核心蛋白均转换成pdbqt格式文件。运行AutoDockTools对有效成分和核心蛋白分别进行对接，保存最低结合能数据作为分子对接的结果。结合能越低，表明活性成分与靶蛋白的结合力越强。一般认为结合能≤-5.0 kJ/mol的药物分子与靶点具有较好的结合活性。

2 结果

2.1 复方化学成分及药物靶点

本研究共收集大柴胡汤药物化学成分151个，其中数据库收集151个;中药预测靶点1 190个，合并去重后收集260个，通过UniProt数据库对药物靶基因进行校正，使其名称格式标准化。大柴胡汤各中药化学成分及预测靶点数量见表1。

2.2 疾病靶点的获取

在GeneCards、OMIM-NCBI、PharmGkb数据库中以“Cholecystitis、Calculous chole-cystitis”为关键词进行检索，经合并去重共获得485个候选靶标。

2.3 获取复方-疾病交集基因

基于R语言3.6.0，在R语言中Bioconductor（https：//www.bioconductor.org/）网站安装VennDiagram程辑包，运行程序获取交集基因并绘制韦恩图。见图1。共获得复方-疾病交集基因55个，交集基因见表2。

2.4 构建有效成分-靶点网络图

运用Cytoscape 3.8.0中Import Network插件构建复方有效化学成分-靶点作用网络。见图2。复方有效化学成分见表3。网络共有123个节点，357条边。方形代表交集基因，三角形代表有效化学成分。化学成分所属药物用颜色显示，其中绿色代表柴胡，草绿色代表黄芩，浅红色代表大黄，浅蓝色代表大枣，深蓝色代表半夏，紫色代表枳实，红色代表白芍，生姜所含有效成分被共有化学成分所覆盖。网络中化合物与靶点的关系用每条边来显示。网络图说明大柴胡汤治疗结石性胆囊炎的过程是多成分、多靶点起效的复杂网络，这也与中药作用的复杂性不谋而合。

2.5 核心PPI网络构建及核心蛋白筛选

对交集基因初步构建PPI网络见图3。网络图包括57个节点，551条边。节点代表蛋白质，边代表蛋白质与蛋白质之间的作用关系。网络连接程度越高说明蛋白质之间关系越密切。筛选核心蛋白基因，核心蛋白见表4（按度值排列前20的蛋白）。筛选流程见图4。计算构建网络的Betweennes、Closeness、Degree、Eigenvector、LAC数值，按数值的大小进行同心圆排列，数值越大颜色越深且位于中心位置。见图5。

2.6 交集基因的GO功能富集分析

基于R软件3.6.0对大柴胡汤治疗结石性胆囊炎的55个作用靶点进行GO功能富集分析。富集内容包括细胞组分，生物过程，分子功能。富集条件为P≤0.05且Q≤0.05。通过分析发现，富集到了2 307个GO条目。细胞组分92个，主要有膜筏、膜微区、膜区、囊腔、胞质小泡腔、小凹、质膜筏、分泌颗粒腔、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物等。生物过程2 126个，主要涉及腺体发育、氧化应激反应、对营养水平反应、细胞对氧化应激反应、丝氨酸/苏氨酸激酶活性的正调控、对金属离子的反应、活性氧代谢过程、对活性氧的反应、细胞对活性氧的反应、对镉离子的响应等。分子功能89个，主要有受体配体活性、细胞因子活性、细胞因子受体结合、磷酸酶结合、蛋白磷酸酶结合、生长因子活性、激素受体结合、抗氧化活性、蛋白酶结合、组蛋白乙酰转移酶结合等。选取各排名前10的富集条目，绘制条形图。见图6。

2.7 交集基因的KEGG通路富集分析

基于R语言的“Pathview”在线程辑包，对交集基因进行KEGG通路富集分析。分析结果发现，55个复方-疾病交集基因共富集到了150条通路（P<0.05），主要涉及AGE-RAGE信号通路、白细胞介素-17信号通路、HIF-1信号通路。选取富集基因数目前20的通路进行可视化处理，颜色表示通路富集到的数目，数目越大颜色越偏向红色，数目越小则越偏向蓝色。见图7。各通路富集基因数目所占百分比见图8。

2.8 分子对接分析

通过有效成分-靶点网络图显示，槲皮素（MOL000098）、木犀草素（MOL000006）、柚皮素（MOL004328）、β-谷甾醇（MOL000358）是大柴胡汤治疗结石性胆囊炎的有效化学成分。通过PPI网络分析，TNF-α、CCK、EGFR、AKT1、VEGFA是大柴胡汤治疗结石性胆囊炎的核心蛋白。将有效化学成分与核心蛋白进行分子对接，结果显示，TNF-α与槲皮素、木犀草素、柚皮素;CCK与槲皮素、β-谷甾醇;EGFR与槲皮素、木犀草素;AKT1与槲皮素、木犀草素、柚皮素;VEGFA与槲皮素、木犀草素均有较好的结合活性。大柴胡汤中的槲皮素、木犀草素等核心有效成分能够与TNF-α、CCK等核心蛋白发生相互作用，治疗结石性胆囊炎。分子对接结果见表5，图9。

3 讨论

中医并无胆囊炎的记载，但根据其发作时引起右上腹剧烈疼痛，伴有黄疸等临床特征，将其归为“胁痛”“胆胀”“黄疸”等范畴，多因饮食不节，损伤脾胃，情志不畅，肝气郁结，导致湿热内蕴，肝胆瘀滞而发病[6]。大柴胡汤是《伤寒杂病论》中表里双解的代表方剂，具有和解少阳，内泻热结的作用[7-8]。现代药理学研究显示，大柴胡汤复方能通过保肝、利胆、抗血小板聚集、抑制离体平滑肌来治疗胆石症[9]。黄敏等[10]发现大柴胡汤能调整黄疸大鼠MRP2蛋白的表达，加速胆汁和胆红素的排泄，促进胆汁的排出，改善黄疸症状的功效。徐迎涛和孙雪萍[11]发现加味大柴胡汤可明显降低血浆WBC数目及胆囊局部TNF-α含量。在临床上大柴胡汤被广泛应用于胆囊炎的治疗。

本研究基于网络药理学的方法[12]，研究大柴胡湯治疗胆囊炎的作用机制。结果表明，槲皮素（MOL000098 quercetin）、β-谷甾醇（MOL000358 beta-sitosterol）、木犀草素（MOL000006 luteolin）、柚皮素（MOL004328 naringenin）等是其主要的化学成分。既往的研究表明，槲皮素是一种能够有效抑制肿瘤坏死因子和白细胞介素等炎症介质表达的黄酮类化合物，在抗氧化、消炎镇痛等方面疗效显著[13-15]。刘威良等[16]、肖志彬等[17]发现β-谷甾醇具有类激素样抗炎的作用并能够降低机体内肿瘤坏死因子水平。木犀草素能调控炎症反应，抑制IL-6、IL-1B、TNF-α等炎症介质的表达[18]。柚皮素作为一种黄烷酮类物质，具有较强的抗炎及抗氧化作用。邱琦等[19]研究发现，柚皮素可以激活P13K/AKT信号通路，增加SOD的活性，提高细胞的增殖率。在大柴胡汤的主要化学成分里，槲皮素主要来源于柴胡、大枣。β-谷甾醇主要来源于大黄、黄芩、半夏、白芍、大枣、生姜。木犀草素、柚皮素主要来源于枳实。这说明，大柴胡汤可能是通过多味中药中的槲皮素，β-谷甾醇，木犀草素，柚皮素等主要化学成分来限制肿瘤坏死因子等炎症介质的高表达，降低胆囊局部炎症反应，增加胆囊收缩运动来达到治疗胆囊炎的目的。

核心蛋白筛选结果显示，TNF-α（肿瘤坏死因子）、CCK（胆囊收缩素）、EGFR（表皮生长因子受体）、AKT1（AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1）、VEGFA（血管内皮生长因子A）的Degree值较大，在网络中连接程度较高。TNF-α是一种多态性激素，是机体炎症及免疫反应与增强单核细胞活力的重要调节因子，参与机体多种局部和全身的炎症反应[20]。当机体局部TNF-α含量增加时，可以刺激机体分泌IL-1，IL-6等炎症介质，介导炎症反应，也可作为内源性致热源引起发热[21]。当结石性胆囊炎发病时，机体内TNF-α含量升高，胆囊局部发生炎症反应，引起发热。胆囊局部的炎症反应是引起胆囊炎发病的重要基础，当胆囊炎发生时，机体释放大量的TNF-α，引起发热，胆囊局部渗出增多，发生右上腹疼痛。CCK作为一种人体分泌的脑肠肽激素，能促进胆囊的收缩运动以利胆，促进胆汁排泄;降低食管括约肌张力，抑制胃排空[22]。机体内的CCK含量降低，导致胆囊运动功能障碍，胆汁排泄障碍，淤积于胆囊内易形成结石，导致结石性胆囊炎发病。大柴胡汤中的有效化学成分可以作用于机体中CCK受体，调节胆囊的收缩运动，达到治疗结石性胆囊炎的目的。EGF是EGFR主要配体之一，能够刺激周围神经修复和再生[23]。另外，Daniela M[24]研究发现EGFR可以通过促进配体EGF的高表达来促进血管淋巴管的再生，刺激周围神经的修复和再生。当结石性胆囊炎发病时，会造成胆囊局部发生炎性病变，局部淋巴管及血管通透性受阻。大柴胡汤通过作用于EGFR以介导炎症反应，修复受损的周围神经及血管来达到治疗结石性胆囊炎的目的。AKT又称PKB（Protein Kinase B），是丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞的生长及凋亡中起到重要作用。AKT1作为AKT的亚型之一，广泛表达于人体各个组织，参与了细胞的成活及生长调控[25]。AKT1可能是通过提高细胞因子活性促进胆囊局部病变细胞的凋亡来达到治疗胆囊炎的目的。VEGFA是血管内皮生长因子（VEGF）的一个亚型，通过诱导内皮细胞增殖，促进细胞迁移并抑制凋亡，在血管生成及内皮细胞生长中扮演着重要角色[26]。结石性胆囊炎发病时导致胆囊系统发生炎症反应，严重时局部缺血缺氧，甚者出现微血管血栓形成，发生微循环障碍。VEGFA能促进血管生成，从而改善胆囊炎症时的局部缺血缺氧状态，以缓解疼痛，抑制炎症，达到治疗疾病的目的。

交集基因KEGG通路富集分析，其通路主要包括AGE-RACE信号通路、HIF-1信号通路、白细胞介素-17信号通路等。既往的研究表明，杨超茅等[27]发现AGE-RACE信号通路能够激活逆转录因子核因子κB（Nuclear Factor-κB），从而使得细胞核表达和释放大量的黏附因子、生长因子、炎症介质（白细胞介素-6，肿瘤坏死因子-α）等，从而导致机体损伤。核因子κB又可以增强AGE-RACE信号通路的表达，使得该通路能够持久作用于细胞[28]。HIF-1是介导机体对缺氧环境适应性反应的关键转录激活因子，能够随着细胞中氧浓度的变化而改变基因表达[29]。局部炎症反应是胆囊炎病变的基础，有效地控制炎症对治疗胆囊炎具有明显的促进作用。在胆囊炎的发生发展过程中会释放大量的炎症介质，IL-17信号通路能够调控IL-4、IL-6、TNF-α、COX2等炎症介质，阻断IL-17信号通路能够有效抑制炎症介质的释放，达到治疗疾病的目的。

综上所述，本研究基于网络药理学的方法，分析大柴胡汤治疗胆囊炎的机制。结果显示，大柴胡汤治疗胆囊炎主要是通过槲皮素、β-谷甾醇等多种潜在化学成分作用于肿瘤坏死因子、胆囊收缩素、表皮生长因子受体、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1等基因，从而调节多种生物学功能以及多条通路来达到治疗目的。本研究为后续进一步探讨机制和优化实验设计提供支持，同时，本研究也为中药及其复方治疗某种疾病的机制分析提供了研究方法。

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（2020-12-09收稿 本文编辑：杨燕）