基于网络药理学的济川煎治疗便秘的作用机制研究

褚怡霏 叶健飞 王振宜

摘要 目的：基于网络药理学方法研究济川煎治疗便秘的药理机制及作用靶点。方法：使用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）筛选济川煎中6味中药的化学成分及其作用靶点，通过GeneCards、OMIM、TTD、DisGeNET、Drugbank数据库查询便秘的疾病靶点;利用R语言筛选成分和疾病的交集靶点，利用STRING数据库构建靶点蛋白互作网络;运用Cytoscape（3.8.0）软件构建中药-化学成分-便秘疾病靶点网络图;利用R语言对靶基因进行基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。结果：筛选出槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、β-谷甾醇、柚皮素、黄芩素6个主要化学成分，PTGS2、PTGS1、NCOA2、SCN5A、ADRB2、AR 6个关键靶点，GO富集分析显示靶点相关功能主要涉及对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、对氧化应激的反应等，KEGG富集分析显示靶点相关通路主要涉及药物代谢-细胞色素P450、细胞色素P450对异生素的代谢、视黄醇代谢等。结论：济川煎可能通过多靶点、多通路协同作用，发挥抗炎、抗氧化等作用，从而改善便秘。

关键词 济川煎;便秘;网络药理学;作用机制;药效物质;药物靶点;槲皮素;山柰酚

Abstract Objective：To investigate the pharmacological mechanisms and action targets of Jichuan Decoction in the treatment of constipation based on a network pharmacology approach.Methods：Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP） were used to screen the chemical components and action targets of 6 Chinese medicinals in Jichuan Decoction.The disease targets of constipation were queried through Genecards，OMIM，TTD，DisGeNET，DRUGBANK databases.The intersection targets of ingredients and diseases were screened using the R（4.0.3）.STRING database was used to construct the target protein interaction network.The network diagram of TCM chemical component and constipation disease target was constructed using Cytoscape（3.8.0） software.The GO enrichment analysis and KEGG enrichment analysis of target genes were performed using R language.Results：A total of 6 main chemical compounds include quercetin，kaempferol，wogonin，β-sitosterol，naringenin，and baicalein.A total of 6 key targets were PTGS2，PTGS1，NCOA2，SCN5A，ADRB2 and AR.GO enrichment analysis showed that the target-related functions mainly involved in response to lipopolysaccharide，response to molecule of bacterial origin，response to oxidative stress etc.And the KEGG enrichment analysis showed that the target-related pathways mainly involved in drug metabolism-cytochrome P450，metabolism of xenobiotics by cytochrome P450，Retinol metabolism，etc.Conclusion：Jichuan Decoction may relieve constipation by exerting anti-inflammatory，antioxidant，and other effects through multi-target and multi-pathway synergistic effects.

Keywords Jichuan Decoction; Constipation; Network pharmacology; Mechanism of action; Pharmacodynamic substances; Drug targets; Quercetin; Kaempferol

中圖分类号：R285文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.01.012

便秘（Constipation）是最常见的胃肠疾病之一，其特征主要为患者对排便情况不满意，包含排便少、排便困难或二者兼有[1]。有研究估计便秘在一般人群中的患病率为12%～19%，患病率随年龄增长而增加，在女性中更为常见[2-3]。在便秘相关的研究中，在65岁以上的人群中，有26%的女性和16%的男性认为自己患有便秘;在84岁以上的人群中，有34%的女性和26%的男性认为自己患有便秘。便秘治疗方法众多，西医治疗以泻药为主，有研究表明，西方社会医生会为近85%的便秘就诊患者开具泻药处方[4-5]。但此种方法易产生依赖性，因此中药治疗便秘具有独特的优势。

济川煎出自《景岳全书》，由当归、牛膝、肉苁蓉、泽泻、升麻、枳壳6味中药组成。张景岳称此方为“用通于补之剂”，故适宜于肾阳虚弱，精津不足便秘者，临床上常用于治疗多种因素导致的便秘。方中肉苁蓉温肾益精，润肠通便，为君药。当归补血和血，牛膝补肾强筋，共为臣药。枳壳行气导滞，泽泻利湿泻浊，升麻升阳降浊共为佐药。诸药合用使肾阳得充，气化得复，肠得濡润而便秘渐愈[6]。

中药复方治疗便秘优势突出，其作用机制具有靶点丰富、途径多样、安全有效等特征，在改善患者症状方面具有极大潜力。网络药理学是基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络，分析网络中各个节点与相关药物的关系，以探讨药物的作用机制，有助于推动中药复方的传承和发展[7]。

本研究基于网络药理学的方法，基于济川煎的分子成分，构建“药物成分-靶点-基因”网络，着眼于整体分析济川煎调治便秘的分子机制，为后续的研究提供一定的理论基础。

1 资料与方法

1.1 软件与数据库

R（4.0.3）软件、RStudio平台及VennDiagram、ClusterProfiler[8]、ggplot2程辑包，Cytoscape 3.8.0软件及MCODE、CytoHubba插件，中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php），UniProt（Universal Protein，https：//www.uniprot.org），DisGeNET（http：//www.disgenet.org）、GeneCards（http：//www.genecards.org）、在線人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https：//omim.org）、治疗靶点数据库（Therapeutic Target Database，TTD，http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd）、Drugbank（https：//go.drugbank.com），STRING 11.0（https：//string-db.org）。

1.2 济川煎相关靶点筛选

基于TCMSP[9]，寻找当归、牛膝、肉苁蓉、泽泻、升麻、枳壳6味中药的化学成分，并结合口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%且类药性（Drug Likeness，DL）≥0.18进行活性化合物的初步筛选，并利用TCMSP获取与筛选得到的活性化合物相对应的靶点。为使蛋白质靶点信息标准化，将筛选后的靶点统一在UniProt蛋白质数据库进行检索以规范。

1.3 便秘相关靶点筛选

以“Constipation”为关键词，通过GeneCards数据库、OMIM数据库、TTD数据库[10]、DisGeNET数据库挖掘便秘疾病的潜在靶点，并通过Drugbank数据库寻找治疗便秘的临床一线西药作用靶点进行补充[11]。合并5个疾病数据库靶点后，删除重复值作为便秘的预测靶点库。

1.4 济川煎成分-便秘靶点PPI网络构建

为明确济川煎药物相关靶点与便秘疾病靶点间的相互作用，利用R语言VennDiagram包筛选二者靶点的交集并绘制韦恩图。将所取交集靶点上传至STRING 11.0数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）网络模型，将物种设置为“Homo Sapiens”，设定最小相互作用阈值为最高置信（Highest Confidence>0.9），构建PPI网络。并通过Cytoscape 3.8.0软件中的MCODE插件对该结果进一步分析，得到潜在蛋白质功能模块并对其功能进行描述。同时通过Cytoscape 3.8.0软件中的CytoHubba插件的MCC算法筛选Hub基因。

1.5 基因本体富集功能分析和京都基因与基因组百科全书通路富集分析

为确定基因的主要功能，使用R（4.0.3）软件ClusterProfiler程辑包对靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，并用ggplot2程辑包绘制条形图。

1.6 中药-化学成分-便秘疾病靶点网络图的构建

运用Cytoscape 3.8.0软件构建中药-化学成分-便秘疾病靶点网络图，分析得到化学成分与对应靶点之间的连接度、介度及紧密度等，并根据其网络拓扑结构分析得出主要化学成分及关键对应靶点。

2 结果

2.1 济川煎活性成分及对应靶点的获取

济川煎中当归化学成分2种，牛膝化学成分20种，肉苁蓉化学成分6种，泽泻化学成分10种，升麻化学成分17种，枳壳化学成分5种。见表1。当归作用靶点69个，牛膝作用靶点444个，肉苁蓉作用靶点223个，泽泻作用靶点9个，升麻作用靶点83个，枳壳作用靶点123，共得到靶点255个。

2.2 便秘疾病相关靶点的获取

从GeneCards数据库获取便秘靶点5 053个，根据经验设定疾病与靶点的关联分数（Relevance score）大于中位数的目标靶点为便秘的潜在靶点。此处通过GeneCards数据库获取的便秘靶点关联分数最大值为30.61，最小值为0.2，中位数为3.39，故设定关联分数>3.39的靶点为便秘疾病的潜在靶点。结合Drugbank数据库、OMIM数据库、TTD数据库、DisGeNET数据库最终得到2 158个便秘疾病相关靶点。

2.3 济川煎成分-便秘靶点PPI网络的构建

利用R（4.0.3）软件及VennDiagram程辑包，筛选出济川煎潜在靶点和便秘疾病相关靶点的交集靶点164个，并绘制韦恩图。见图1。将164个交集靶点提交至STRING 11.0平台，得到济川煎成分-便秘靶点PPI网络。在此PPI网络图中，共有164个节点，580条边。见图2。

将PPI网络信息导入Cytoscape 3.8.0软件中，运用MCODE插件分析得到Module，并保留其中3个评分最佳的生物过程。见图3。同时通过CytoHubba插件中的MCC算法分析济川煎成分-便秘靶点PPI网络中的每个节点，筛选排名前10的靶点。颜色从红到黄代表该靶点的重要程度递减，依次为JUN、MAPK3、TP53、FN1、MAPK1、TIMP1、ALB、ESR1、VEGFA、TGFB1。见图4。

2.4 GO富集功能分析和KEGG通路富集分析

运用R（4.0.3）软件及ClusterProfiler程辑包对164个交集靶点进行GO富集功能分析和KEGG通路富集分析。主要参与的生物过程（Biological Process，BP）包括对脂多糖的反应（Response to Lipopolysaccharide）、对细菌来源分子的反应（Re-sponse to Molecule of Bacterial Origin）、对氧化应激的反应（Response to Oxidative Stress）、对金属离子的响应（Response to Metal Ion）、对营养水平的反应（Response to Nutrient Levels）、细胞对化学应激的反应（Cellular Response to Chemical Stress）。见图5-1。所涉及的分子功能（Molecular Function，MF）主要有蛋白酶结合（Protease Binding）、血红素结合（Heme Binding）、抗氧化活性（Antioxidant Activity）、Dna结合转录因子结合（Dna-Binding Transcription Factor Binding）、Rna聚合酶ii特异性dna结合转录因子结合（Rna Polymerase Ii-Specific Dna-Binding Transcription Factor Binding）、四吡咯结合（Tetrapyrrole Binding）。见图5-2。所涉及的细胞组分（Cell Component，CC）主要有膜筏（Membrane Raft）、膜微区（Membrane Microdomain）、膜区域（Membrane Region）、囊泡腔（Vesicle Lumen）、Rna聚合酶ii轉录调节复合物（Rna Polymerase Ii Transcription Regulator Complex）、分泌颗粒腔（Secretory Granule Lumen）。见图5-3。参与的通路主要有药物代谢-细胞色素P450（Drug Metabolism-Cytochrome P450）、细胞色素P450对异生素的代谢（Metabolism of Xenobiotics by Cytochrome P450）、视黄醇代谢（Retinol Metabolism）、酪氨酸代谢（Tyrosine Metabolism）、药物代谢-其他酶（Drug Metabolism-Other Enzymes）、类固醇激素生物合成（Steroid Hormone Biosynthesis）。见图5-4。

2.5 中药-化学成分-便秘疾病靶点网络图的构建

运用Cytoscape 3.8.0软件构建中药-化学成分-便秘疾病靶点网络。该图中共包含267个节点，574条边。见图6。长方形节点代表中药，不同颜色的圆形节点代表化学成分，菱形节点代表便秘疾病靶点。其中A1为当归、牛膝、肉苁蓉、枳壳共有化学成分;B1为当归、牛膝、升麻共有化学成分;C1为牛膝、肉苁蓉共有化学成分;D1为泽泻、升麻共有化学成分。节点的面积代表其度数，即面积越大，说明该节点越重要。

通过Cytoscape 3.8.0软件分析得到核心化学成分及核心疾病靶点。济川煎化学成分连接度（Degree）中连接度最高为槲皮素（连接度：142），预测其为济川煎治疗便秘的主要成分，其次为山柰酚、汉黄芩素、β-谷甾醇、柚皮素、黄芩素。便秘靶点连接度中连接度最高为PTGS2（连接度：24），预测其为济川煎治疗便秘的主要靶点，其次为PTGS1、NCOA2、SCN5A、ADRB2、AR。

3 讨论

便秘是常见的健康问题之一，它会引起患者的不适，影响患者的生命质量[12]。便秘的症状多样，常随着患者年龄的增长而增加，不仅会引起不适，还会引起焦虑、腹胀、呕吐、肠梗阻和穿孔等并发症，有病例报道其甚至可能导致肺栓塞[13]。

研究提示中药复方相比于导泻药在便秘症状改善方面具有更大的潜力。顾尽晖等[14]研究发现，济川煎可改善结肠慢传输性便秘模型大鼠的症状，其机制一方面为增加大鼠胃肠神经递质含量、胃肠组织Cajal间质细胞数量，加快胃肠信息转导，从而加快胃肠平滑肌蠕动，促进肠道内容物通过，缩短排便时间;另一方面济川煎可能通过抑制肠道水分的吸收，增加粪便含水量，从而刺激胃肠蠕动，起到缓解便秘的作用。杨颖等[15]研究发现，慢传输性便秘模型大鼠经济川煎治疗后，其首粒黑便时间显著减少，粪便干湿重百分比也显著下降，P物质（SP）显著增加，血管活性肠肽（VIP）显著减少，并且大肠埃希菌含量显著降低，双歧杆菌和乳酸菌含量则显著升高，说明济川煎对STC大鼠具有调节肠道菌群平衡和促进排便的作用。张双喜等[16]研究发现，对于老年慢性功能性便秘患者，服用琥珀酸普芦卡必利片加济川煎相较于单纯服用琥珀酸普芦卡必利片，全胃肠排出率、胃排空率、血清5-HT，SP含量均明显升高，血清NO含量明显降低，乳杆菌、双歧杆菌数量均明显升高，酵母菌、肠杆菌数量均明显降低，肠道菌群水平趋于稳定。匡晓雯等[17]随机将146例老年慢性功能性便秘患者分为2组，对照组服用乳果糖和普芦卡必利，观察组在此基础上加服济川煎，均持续治疗1个月，观察组排便时间评分、粪便性状评分、排便费力评分低于对照组;观察组模拟排便时直肠压力较前升高且高于对照组，2组初始阈值、排便阈值及最大耐受阈值均降低，且观察组低于对照组。

本研究对济川煎中当归、牛膝、肉苁蓉、泽泻、升麻、枳壳共6味中药的有效成分进行分析，通过网络药理学方法初步筛选出济川煎调治便秘疾病的活性成分主要为槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、β-谷甾醇、柚皮素、黄芩素等。槲皮素能够显著增加结肠慢传输型便秘模型大鼠的排粪量，其机制与通过乙酰胆碱受体（mAChRs）调节肠胃平滑肌细胞的蠕动功能，并促进其分泌黏蛋白有关[18]。山柰酚具有抑制PGE2和NO释放的能力，并能中和自由基，降低编码iNOS和COX-2的mRNA的表达水平，减轻炎症介质肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）-α造成的细胞损伤，改善肠道稳态[19]。汉黄芩素能够显著下调LPS诱导的THP-1细胞中典型炎症介质白细胞介素（Interleukin，IL）-6和IL-1β的分泌，减少周围组织中的核因子κB的表达，改善肠道炎症，维持肠道内稳态[20]。β-谷甾醇能够以浓度依赖的方式降低结肠炎小鼠肠道组织中TNF-α，IL-6和IL-1β的水平，并显著增加肠上皮细胞中抗菌肽的表达，降低肠道炎症病原菌的存活率，减轻炎症对肠道环境的干扰[21]。柚皮素可调节血清中胃肠代谢相关成分的产生。研究提示柚皮素缓解便秘症状的机制可能与上调LOP诱导便秘小鼠的Cajal间质细胞（ICC）标志物（c-Kit和SCF）和AQP3的表达增加有关[22]。黄芩素通过作用于cMAP途径，刺激大鼠结肠黏膜的Cl（-）分泌，从而引起I（sc）响应，以激活肠道神经系统，促进平滑肌运动改善大鼠便秘症状[23]。

综合中药-化学成分-便秘疾病靶点网络及交集靶点PPI网络，预测济川煎调治便秘疾病的异常靶点主要为PTGS2、PTGS1、NCOA2、SCN5A、ADRB2。环氧合酶1（COX-1/PTGS1）的表达及其主要代谢产物内源性前列腺素（PGs），通过调节黏膜完整性和消化道的各种功能改善排便情况[24]。环氧合酶2（COX-2/PTGS2）的表达及其主要代谢产物前列腺素E2（PGE2）通过调节结直肠收缩功能以助于调节排便[25]。Wnt3a是Wnt信号分子家族中的一个重要成员，已被证明能促进成肌细胞的增殖和分化[26]。Wnt3a表达下调抑制了肌源性祖细胞从增殖向肌源性分化的转变，从而导致平滑肌细胞（Smooth Muscle Cell，SMC）成熟延迟[27]。NCOA2通过同时上调Wnt/β-catenin的抑制剂和下调刺激剂来抑制Wnt/β-catenin信号转导，以改善SMC功能，进而调节排便[28]。SMC和Cajal间质细胞（ICC）上的電压门控机械敏感性钠通道由SCN5A编码，可调控肌细胞收缩，控制肠蠕动，进而改善便秘症状[29]。β（2）-肾上腺素受体（ADRB2）能够介导多巴胺诱导的大鼠结肠远端离子迁移，引起细胞内cAMP浓度改变，促进肠蠕动及抑制胃肠道水分吸收，进而改善便秘症状[30]。

综上所述，本研究基于网络药理学办法，对“济川煎-有效成分-便秘疾病靶点”进行多维度分析，初步探究了济川煎治疗便秘疾病的潜在机制过程，体现了中药方剂多靶点联合干预的作用特点，为进一步探究济川煎治疗便秘的机制提供了新研究方向，也为济川煎治疗便秘的临床应用提供了理论依据。但同时因网络药理学方法的局限性[31]，以及复方中药用量配比及中药煎煮后有效成分可能发生的变化，因此仍须进一步的药理及动物实验验证，以明确济川煎对于便秘疾病主要的调控靶点。

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（2021-01-11收稿 本文编辑：魏庆双）