基于OPG/RANKL信号轴探讨二至丸治疗绝经后骨质疏松的作用机制

姜宜妮 梁健 刘江源 伍庆华 闵建新

摘要 目的：探討二至丸治疗绝经后骨质疏松模型鼠的作用机制。方法：将108只雌性SD鼠随机分为假手术（Sham）组、模型（PMOP）组、雌激素治疗（E2）组、二至丸低剂量治疗（EZW-L）组、二至丸中剂量治疗（EZW-M）组、二至丸高剂量治疗（EZW-H）组，每组18只。E2组接受E2针剂皮下注射，EZW-L组、EZW-M组、EZW-H组分别予以6 g/kg、9 g/kg、12 g/kg混悬液灌胃，Sham组与PMOP组均予以1 mL生理盐水灌胃，均干预12周。检测各组大鼠右侧股骨头骨密度（BMD）、股骨生物力学/病理变化以及骨代谢血清标志物BALP、TRACP-5b、Cath-K、OPG、RANK、RANKL的水平变化。结果：药物干预12周后，与PMOP组比较，EZW-M组、E2组、EZW-H组的BMD、弹性模量、最大载荷、BV/TV、Tb.Th、Joint、血清骨代谢标志物BALP、TRACP-5b、Cath-K的蛋白表达均显著增高（均P<0.05），FLAW显著降低（P<0.05）;HE染色显示PMOP组骨组织出现明显病理改变，E2组和EZW-H组疏松病理现象改善明显。POMP组、EZW-L组、EZW-M组股骨中OPG蛋白含量较Sham组、E2组、EZW-H组明显下降;RANK、RANKL蛋白含量升高。与PMOP组比较，EZW-M组的OPG/RANKL比值显著增高（P<0.05），RANK/RANKL比值显著降低（P<0.05），E2组、EZW-H组的OPG/RANKL比值显著增高（P<0.01），E2组、EZW-H组的RANK/RANKL比值显著降低（P<0.01）。结论：二至丸可改善骨质疏松，其作用机制可能是OPG骨保护素重组蛋白/核因子κB受体激活物配体/RANKL信号轴抑制破骨细胞成熟分化实现的。

关键词 骨质疏松;绝经后;二至丸;生物力学;病理改变;机制;骨保护素重组蛋白;核因子κB受体激活物配体

Abstract Objective：To explore the mechanism of Erzhi Pills in the treatment of postmenopausal osteoporosis model rats.Methods：A total of 108 female SD rats were randomly divided into a sham operation（Sham） group，a model（PMOP） group，an estrogen treatment group（E2），an Erzhi Pill low dose treatment group（EZW-L），an Erzhi Pill medium dose treatment group（EZW-M） and an Erzhi Pill high dose treatment group（EZW-H），with 18 rats in each group.Group E2 received subcutaneous injection of E2.Group EZW-L，group EZW-M and group EZW-H were given intragastric administration of 6g/kg，9g/kg and 12 g/kg suspension respectively.group Sham and group PMOP were given intragastric administration of 1ml normal saline for 12 weeks.The bone mineral density（BMD） of right femoral head，biomechanical/pathological changes of femur and the levels of serum markers of bone metabolism，such as BALP，TRACP-5b，Cath-K，OPG，RANK and RANKL，were measured in each group.Results：After 12 weeks of drug intervention，the protein expressions of BMD，elastic modulus，maximum load，BV/TV，Tb.Th，Joint，serum bone metabolic markers BALP，TRACP-5b and BCath-K in EZW-M group，E2 group and EZW-H group were significantly higher than those in EZW-H group（Ps<0.05），and FLAW significantly lower（P<0.05）.HE staining showed that there were obvious pathological changes in bone tissue in PMOP group，and the above-mentioned loose pathological phenomena were significantly improved in E2 group and EZW-H group.The content of OPG protein in femur of POMP group，EZW-L group and EZW-M group was significantly lower than that of Sham group，E2 group and EZW-H group，while the content of RANK and RANKL protein was increased.Comparing with PMOP group，OPG/RANKL ratio in EZW-M group was significantly higher（P<0.05）; RANK/RANKL ratio was significantly lower（P<0.05）; OPG/RANKL ratio in E2 group and EZW-H group was significantly higher（P<0.01）; and RANK/RANKL ratio in E2 group and EZW-H group was significantly lower（P<0.01）.Conclusion：Erzhi Pill can improve osteoporosis，and its mechanism may be related to the inhibition of osteoclast maturation and differentiation by OPG/RANK/RANKL signal axis.

Keywords Osteoporosis; Postmenopausal; Erzhi Pill; Biomechanics; Pathological changes; Mechanism; OPG; RANKL

中图分类号：R289.5;R274.9文献标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.01.016

绝经后骨质疏松症（Postmenopausal Osteoporosis，PMOP）是指绝经后女性的卵巢功能衰退、内分泌失调、雌激素水平下降，导致成骨细胞的骨形成低于破骨细胞的骨吸收，造成骨组织微结构破坏，骨小梁排列紊乱，使得骨密度下降、骨脆性增加，易于发生骨折，严重影响中老年女性的生命质量[1]。目前研究认为，骨保护素重组蛋白（Osteoprotegerin，OPG）/核因子κB受体激活物配体（NF-κB Receptor Activator Ligand，RANKL）信号轴是参与调节骨吸收与骨生成平衡的重要途径，其在雌激素治疗PMOP中起着举足轻重的作用[2]，然而雌激素的不良反应令人担忧[3-4]，因此寻找一种安全有效的防治方法迫在眉睫。PMOP属中医学中“骨痿”“骨枯”等的范畴，主要病因病机为肾精亏虚、骨髓生化乏源。补肾阴经典方二至丸（女贞子、墨旱莲）具有滋肾阴、益精血之效，可抑制骨量减少、改善骨微结构的改变，增强骨强度和生物力学强度[5-6]，不仅能够预防PMOP的发生发展，而且能够改善PMOP临床症状[7-8]，但机制未明。为此，本研究建立绝经后骨质疏松大鼠模型，观察二至丸对骨代谢的影响与OPG/RANKL信号轴的相关性，探讨二至丸改善绝经后骨质疏松的分子机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选用SPF级20周龄SD雌性大鼠，体质量（320±20）g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司[许可证号码：SCXX（沪）2007-0005]提供，动物实验在江西中医药大学动物实验中心进行[许可证号为：SYXK（闽）2005-004]。饲养环境：温度（25±2）℃，湿度（50±1）%，昼夜12 h/12 h交替。实验过程中，实验大鼠可自由进食和饮水。实验经江西中医药大学动物管理制度和使用委员会批准而进行，并严格按照科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》中的动物伦理学标准处理动物。

1.1.2 药物 二至丸（500粒/瓶，雷允上药业有限公司，国药准字Z32020882）。悬浊液制备：以成人临床用药剂量按照人和动物等效剂量换算公式计算动物用药剂量，用0.9%生理盐水将二至丸配制成90 mg/mL的混悬液，4 ℃冰箱储存备用。

1.1.3 试剂与仪器 雌二醇（E2）针剂（100 μg/支，武汉峰耀同辉化学制品有限公司，国药准字Z38922），戊巴比妥钠（广州沛瑜生物制品有限公司，批号：2930-2），OPG一抗抗体（货号：68495S）、RANK一抗抗体（货号：4816S）、RANKL一抗抗体（货号：5312SC）、β-actin一抗抗体（货号：4870t）均购于美国CST公司，BALP ELISA试剂盒（上海科顺生物工程有限公司，货号：KS15752）、TRACP-5b ELISA试剂盒（南京森贝伽生物工程有限公司，货号：SBJ-R0426）、Cath-KELISA试剂盒（上海江莱生物工程有限公司，货号：JL11782）;双能X线BMD仪（奥斯托公司，韩国，型号：EXA-3000），转膜系统（Bio-Rad公司，美国，型号：1704150），台式低温高速离心机（BECKMAN公司，美国，型号：X22），酶标自动分析仪（biotek公司，美国，型号：ELx800），精密电子万能材料试验机（大迈仪器有限公司，型号：AG-IS），微计算机断层扫描设备（Micro-CT，BRUKER microCT公司，美国，型号：SKY SCAN-1172）等。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 运用随机数字表法将108只SD大鼠随机分为2组：其中，18只假手术组，90只手术组。假手术组不切除卵巢，手术组进行PMOP造模。PMOP模型的制备：手术组大鼠用戊巴比妥钠（10 g/L）按照3 mg/kg剂量进行腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉后分别从双侧背部切开进入腹腔，依次摘除双侧卵巢，止血缝合切口。75%乙醇消毒切口，注射用庆大霉素液涂擦术口防治感染，连续3 d。Sham组大鼠不切除卵巢，而是切除附在卵巢旁边的一块脂肪，大小与卵巢相仿，余过程同造模组。造模后7 d，再将手术组大鼠应用随机数字表随机分为模型（PMOP）组、雌激素治疗（E2）组、二至丸低剂量治疗（EZW-L）组、二至丸中剂量治疗（EZW-M）组、二至丸高剂量治疗（EZW-H）组，每组18只。

1.2.2 给药方法 Sham组：造模术后7 d，使用0.9%生理盐水灌胃（1 mL/100 g），1次/d，连续12周，同时进行正常的饮食以及活动，不做治疗处理。PMOP组：造模术后7 d，使用生理盐水灌胃（1 mL/100 g），1次/d，连续12周，同时进行正常的饮食以及活动，不做治疗处理。E2组：造模术后7 d，用E2针剂皮下注射（200 μg/kg），2次/周，治疗12周，同时进行正常的饮食以及活动。EZW-L组：造模术后7 d，二至丸混悬液（6 g/1 kg）灌胃，1次/d，连续灌胃12周，同时进行正常的饮食以及活动。EZW-M组：造模术后7 d，二至丸混悬液（9 g/1 kg）灌胃，1次/d，连续灌胃12周，同时进行正常的饮食以及活动。EZW-H组：造模术后7 d，二至丸混悬液（12 g/1 kg）灌胃，1次/d，连续灌胃12周，同时进行正常的饮食以及活动。

1.2.3 检测指标与方法 1）骨密度检测：分别取6组大鼠右侧股骨，应用DiscoveryWi双能X线骨密度仪检测右侧股骨头骨密度（Bone Mineral Density，BMD）。2）生物力学检测：应用三点弯曲试验检测股骨生物力学情况。采用AGS-J系列精密电子万能材料试验机检测最大载荷和弹性模量。具体方法：将检测完BMD的股骨头凹面朝下，股骨头端朝前的位置放置于跨距为17 mm的2个支撑点上，压头大概在股骨长度中间位置的正上方给标本施加向下10 mm/min的载荷，直至股骨断裂，股骨断裂前所能承受的最大力为最大载荷，股骨断裂时所承受的力为断裂载荷。3）组织学检测：取6组大鼠右侧股骨头进行常规固定、脱水、包埋、切片后，进行苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察骨组织形态结构的变化。4）骨小梁检测：采用micro CT对各组大鼠右侧股骨进行骨组织形态扫描，由股骨近心端骨骺线消失处开始扫描，直至股骨远心端，扫描厚度10 μm，共扫描70层。应用全自动图像数字化分析仪对所得图片分析处理，记录骨小梁骨体积分数（Bone Volume/Tissue Volume，BV/TV）、骨小梁表面密积度（Trabecular Thickness，Tb.Th）、骨小梁平均间距（Trabecular Separation）、骨小梁数、成骨细胞指数（Osteoblast Index，OBI，个/mm）、矿化沉积率（MAR）、矿化延迟时间（MLT）、骨形成率（BFR）。5）骨代谢标志物血清含量检测：采用酶联免疫吸附剂测定（ELISA）法检测血清中BALP、TRACP-5b、Cath-K含量，具体检测方法按照ELISA试剂盒说明书进行。6）OPG/RANK/RANKL信号轴检测：采用蛋白质免疫印迹法（Western Blotting）检测骨组织中OPG、RANK、RANKL的蛋白含量。将各组大鼠充分麻醉后处死，于冰上快速取出右侧股骨。200 mg大鼠股骨组织加入l mL PMSF，匀浆30 min，将样本置于4 ℃，5 000 r/min，离心半径10 cm条件下离心20 min，取上清液（總蛋白溶液）。检测蛋白浓度（DAB方法），蛋白变性。以50 μg蛋白量为上样标准计算上样量。电泳（12%分离胶，5%浓缩胶，60 V，40 mA，2.0 h），转膜（120 V，250 mA，30～60 min），封闭（5%脱脂奶粉）2 h，分别加入OPG、RANK、RANKL和β-actin一抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，加入碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG（1∶2 000）室温孵育2 h。上述每一过程均用TBS洗3次，5 min/次。加入显色液15～30 min，计算机扫描图像，采用Model Gel Doc 2000型生物图像分析系统处理所得数据信息。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件对结果进行数据分析。所有结果均选择3个或3个以上数据，以均数±标准差（±s）表示，数据符合正态分布，采用单因素方差分析。数据不符合正态分布，采用非参数检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 6组大鼠骨密度比较 药物干预12周后，与Sham组比较，PMOP组、EZW-L组、EZW-M组、EZW-H组股骨BMD极显著降低（均P<0.01）;与Sham组比较，E2组股骨BMD显著降低（P<0.05）;与模型组比较，EZW-M组BMD增高（P<0.05），E2组、EZW-H组的BMD极显著增高（P<0.01）。见表1。

2.2 6组大鼠弹性模量、最大载荷比较 药物干预12周后，与Sham组比较，PMOP组、EZW-L组、EZW-M组、EZW-H组弹性模量、最大载荷显著降低（均P<0.01）;与Sham组比较，E2组股骨弹性模量、最大载荷降低（均P<0.05）;与PMOP组比较，EZW-M组的弹性模量、最大载荷增高（均P<0.05），E2组、EZW-H组的弹性模量、最大载荷极显著增高（均P<0.01）。见表2。

2.3 6组大鼠骨组织病理学比较 在进行药物干预12周后，股骨头HE染色在Sham组呈现的是股骨头致密且厚的周围骨皮质，大小适中的骨髓腔，大小、粗细正常的骨皮质小梁，且排列规律，位于骨陷窝内的骨细胞大小正常，骨细胞与骨陷窝壁紧密镶贴。PMOP组可见股骨头变薄的周围骨皮质，萎缩变小的骨细胞，骨细胞与骨陷窝壁间隙明显增大，并可见变小变短的骨皮质小梁，骨小梁之间间隙明显比Sham组增大，呈明显骨质疏松病理表现。与PMOP组比较，E2组和EZW-H组观察到股骨头周边骨皮质较厚，骨小梁排列密度较均匀，骨小梁之间间隙亦变小，大小正常的骨细胞，骨细胞与骨陷窝之间未见明显腔隙，疏松病理现象被明显改善。E2组和EZW-H组镜下骨组织切片形态结构相近。见图1。

2.4 6组大鼠骨组织形态计量学比较 药物干预12周后，与Sham组比较，PMOP组、EZW-L组、EZW-M组、EZW-H组的骨小梁骨体积分数、骨小梁平均宽度、骨小梁数均极显著减少（均P<0.01），骨小梁平均间距则极明显增加（P<0.01）;与Sham组比较，E2组的骨小梁骨体积分数、骨小梁平均宽度、骨小梁数显著减少（均P<0.05），骨小梁平均间距显著增加（P<0.05）;与PMOP组比较，EZW-M组的骨小梁骨体积分数、骨小梁平均宽度、骨小梁数显著增高（均P<0.05），骨小梁平均间距显著降低（P<0.05），E2组、EZW-H组的骨小梁骨体积分数、骨小梁平均宽度、骨小梁数极显著增高（均P<0.01），骨小梁平均间距极显著降低（P<0.01）。见表3。

2.5 6组大鼠血清骨代谢标志物BALP、TRACP-5b、Cath-K比较 药物干预12周后，与Sham组比较，PMOP组、EZW-L组、EZW-M组的血清骨代谢标志物BALP、TRACP-5b、Cath-K的蛋白表达均显著下降（均P<0.01），E2组、EZW-H组的BALP、TRACP-5b、Cath-K蛋白表达显著下降（均P<0.05）;与PMOP组比较，EZW-M组的血清骨代谢标志物BALP、TRACP-5b、Cath-K的蛋白表达显著增高（均P<0.05），E2組、EZW-H组的BALP、TRACP-5b、Cath-K蛋白表达极显著增高（均P<0.01）。见表4。

2.6 6组大鼠骨组织OPG/RANK/RANKL信号轴蛋白表达情况及比较 药物干预12周后，POMP组、EZW-L组、EZW-M组股骨中OPG蛋白含量较Sham组、E2组、EZW-H组明显下降;而POMP组、EZW-L组、EZW-M组、EZW-H组股骨中RANK、RANKL蛋白含量较Sham组、E2组明显增高。与Sham组比较，PMOP组、EZW-L组、EZW-M组的OPG/RANKL比值显著下降（均P<0.01），E2组、EZW-H组的OPG/RANKL比值显著下降（均P<0.05）;与PMOP组比较，EZW-M组的OPG/RANKL比值显著增高（P<0.05），E2组、EZW-H组的OPG/RANKL比值显著增高（均P<0.01）。与Sham组比较，PMOP组、EZW-L组、EZW-M组的RANK/RANKL比值显著增高（均P<0.01），E2组、EZW-H组的RANK/RANKL比值显著增高（均P<0.05）;与PMOP组比较，EZW-M组的RANK/RANKL比值显著降低（P<0.05），E2组、EZW-H组的RANK/RANKL比值显著降低（均P<0.01）。见图2，表5。

3 讨论

生理情况下，正常的骨代谢周期是骨吸收与骨形成的动态平衡。若某种原因导致正常的骨代谢动态平衡被打破，则出现骨形成小于骨吸收的病理状态，造成骨量的丢失[9-10]。女性绝经后常发生骨质疏松，是由于绝经后女性卵巢功能衰退，减少了雌激素的分泌，骨代谢周期失衡，破骨细胞活性相对增强，加快了骨小梁吸收，陷窝加深，且骨形成率下降，造成骨丢失是不可逆的，引起骨小梁变薄、间隙增宽、连接破坏、骨体积减小等病理特征，导致骨脆性增加，易发生骨折[1]。

近年来国内外研究表明，OPG/RANKL信号轴是女性绝经后骨质疏松症的发生、发展的重要路径之一。OPG是抑制骨吸收、增加皮质骨和松质骨密度、面积和骨强度的关键细胞因子，其主要功能是竞争性地与RANKL结合，阻断RANK与RANKL结合，从而抑制骨吸收，维持骨代谢平衡[11]，因此OPG/RANKL比值可作为衡量骨量及骨健康的重要指标[12]。RANK是诱导破骨细胞成熟的关键细胞因子，其主要功能是在破骨细胞及其前体细胞表面与RANKL结合，促进破骨细胞的成熟、分化，且减慢破骨细胞凋亡[13]。RANKL是调控骨吸收的关键细胞因子。Weitzmann[14]研究认为，RANKL是骨吸收和细胞因子对于破骨细胞的分化成熟的最后下游效应。

在绝经后雌激素缺乏首先是对成骨细胞的直接作用减弱，成骨细胞表达OPG能力减弱，OPG/RANKL比值降低，破骨细胞分化成熟力及活性增强。成骨细胞与破骨细胞均存在雌激素受体，而雌激素可直接作用于成骨细胞的雌激素受体α，上调OPGmRNA及蛋白的表达，增加OPG/RANKL比值[15-16]。体外实验表明[17]，人破骨细胞中OPG mRNA的表达对17β-雌二醇呈剂量及时间依赖性，上调OPG能降低RANKL与RANK相互作用，减少骨吸收。给切除卵巢的小鼠注射OPG能预防骨流失。17β-雌二醇通过抑制RANK旁通路（JNK）活性来调节OPG/RANKL信号轴，从而减弱RANK受体应答力，降低RANK的生物活性[18]。

绝经后骨质疏松归属于中医“骨痿”“骨痹”“骨枯”等疾病的范畴。《医精经义》曰：“肾藏精，精生髓，髓养骨，故骨者，肾之合也，髓者，精之所生也，精足则髓足，髓在骨内，髓足则骨强。”中医认为肾为机体的先天之根本，功能主骨生髓，骨髓生化之源依赖于肾中精气的充盛，肾精的盛衰决定着骨质的强健与衰弱，肾精充盛则骨得所养，肾气充足则推动并调节和控制着机体骨的生长发育。《黄帝内经》亦云“年四十而阴气自半”。女性至更年期，肾气渐衰，精亏血少，则肾阴更显不足，再加之肝火、心火之暗耗，故围绝经期妇女以肾阴虚居多，因此补益肝肾是治疗绝经后骨质疏松的关键。二至丸由女贞子、墨旱莲2味药组成，以《医方集解》记载者为常用方，有益肝肾、补阴血、壮筋骨的功效。

本研究建立PMOP大鼠模型，以不同剂量的二至丸为干预方式，E2治疗为金标准对照，PMOP组大鼠骨切片HE染色可见骨细胞萎缩变小、骨细胞与骨陷窝壁间隙明显增大，是骨质疏松的典型表现，说明本研究模型制备是成功的。通过E2干预后，大鼠股骨骨质疏松情况、骨微结构、骨生物力学、血清骨代谢标志物等改变得到明显好转，骨组织中OPG明显提高，而RANKL和RANK明显降低，OPG/RANKL比值增高，RANK/RANKL比值下降，认为雌激素有通过促进OPG分泌，竞争性地与RANKL结合，抑制RANK与其结合，从而抑制破骨细胞的成熟分化。EZW-M组及EZW-H组也有E2组相似作用，说明其具有雌激素样作用，也能改善骨微结构、骨生物力学，改善骨质疏松，可用于PMOP治疗;其作用机制可能是通过OPG/RANK/RANKL信号轴促进成骨细胞形成，抑制破骨细胞活性。

参考文献

[1]智信，陈晓，苏佳灿.绝经后骨质疏松症发病机制研究进展[J].中国骨质疏松杂志，2018，11（24）：1510-1534.

[2]李小娜.OPG/RANK/RANKL信号通路研究进展[J].河南医学研究，2018，27（10）：1802-1804.

[3]吴隆琦.雌激素替代治疗绝经后骨质疏松症引发的争议[J].中国临床康复，2003，7（3）：452.

[4]黄凌曦.激素替代治疗与乳腺癌发病风险的关系[J].中华乳腺病杂志（连续型电子期刊），2011，5（1）：78-81.

[5]梁文娜，李西海，李冠慧，等.二至丸抑制去势大鼠骨量减少的实验研究[J].世界中西医结合杂志，2017，12（4）：492-495.

[6]梁文娜，李西海，胡柳，等.二至丸抑制绝经后骨质疏松大鼠骨代谢紊乱的作用机制研究[J].中医正骨，2017，29（11）：1-7，14.

[7]林雄浩，吴锦忠.中药复方二至丸的化学成分及抗骨质疏松研究进展[J].解放军药学学报，2009，25（5）：421-424.

[8]刘振涛，张怡元，林煜，等.二至丸促进围绝经期妇女成骨细胞增殖的分子机制[J].中国骨质疏松杂志，2017，4（23）：524-529.

[9]Tan EM，Li L，Indran IR，et al.TRAF6 Mediates Suppression of Osteoclastogenesis and Prevention of Ovariectomy-Induced Bone Loss by a Novel Prenylflavonoid[J].J Bone Miner Res，2017，32（4）：846-860.

[10]Zhou L，Song J，Yang S，et al.Bone mass loss is associated with systolic blood pressure in postmenopausal women with type 2 diabetes in Tibet：a retrospective cross-sectional study[J].Osteoporos Int，2017，28（5）：1693-1698.

[11]黃荣兰，胡文彬，詹庆昊.中医药通过调控骨代谢相关信号通路治疗股骨头坏死的研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2021，27（8）：241-250.

[12]甘国兴，李劲平，刘毓，等.壮骨止痛方调节OPG/RANKL平衡抗绝经后骨质疏松作用[J].中国现代应用药学，2017，34（7）：938-942.

[13]Wang C，Xiao F，Qu X，et al.Sitagliptin，An Anti-diabetic Drug，Suppresses Estrogen Deficiency-Induced OsteoporosisIn Vivo and Inhibits RANKL-Induced Osteoclast Formation and Bone Resorption In Vitro[J].Front Pharmacol，2017，8：407.

[14]Weitzmann MN.The Role of Inflammatory Cytokines，the RANKL/OPG Axis，and the Immunoskeletal Interface in Physiological Bone Turnover and Osteoporosis[J].Scientifica（Cairo），2013，2013：125705.

[15]Frenkel B，Hong A，Baniwal SK，et al.Regulation of adult bone turnover by sex steroids[J].J Cell Physiol，2010，224（2）：305-310.

[16]Galea GL，Meakin LB，Sugiyama T，et al.Estrogen receptor α mediates proliferation of osteoblastic cells stimulated by estrogen and mechanical strain，but their acute down-regulation of the Wnt antagonist Sost is mediated by estrogen receptor β[J].J Biol Chem，2013，288（13）：9035-9048.

[17]Hofbauer LC，Khosla S，Dunstan CR，et al.Estrogen stimulates gene expression and protein production of osteoprotegerin in human osteoblastic cells[J].Endocrinology，1999，140（9）：4367-4370.

[18]Marini H，Minutoli L，Polito F，et al.OPG and sRANKL serum concentrations in osteopenic，postmenopausal women after 2-year genistein administration[J].J Bone Miner Res，2008，23（5）：715-720.

（2020-11-11收稿 本文编辑：杨觉雄）