人参三醇组皂苷质量标准的初步研究

陈小玲，司函瑞，付东兴，赵莹，李平亚

（吉林大学药学院，吉林 长春 130021）

关键字：人参三醇组皂苷；指纹图谱；聚类分析；质量标准；高效液相色谱法

人参是五加科多年生草本植物人参（Panaxginseng C.A.Mey.）的干燥根和根茎，人参皂苷是其主要的成分之一，具有延缓衰老、抗疲劳、保护肝脏和心血管系统、抗应激、抗诱变、抗癌、抗糖尿病、抗氧化和抗炎等药理作用[1]，人参皂苷是一种固醇类化合物，根据苷元结构的不同可分为人参二醇型皂苷、人参三醇型皂苷和齐墩果烷型皂苷[2]，目前已知人参三醇组皂苷主要含有人参皂苷Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh1和PPT（皂苷元原人参三醇）等，结构见图1。研究表明，人参三醇组皂苷经过彻底水解能得到PPT，人参三醇组的人参皂苷Re首先通过水解C-20位的葡萄糖生成人参皂苷Rg2，再水解C-6位的鼠李糖生成人参皂苷Rg1；Rg2水解C-6位的鼠李糖和葡萄糖，Rg1继续水解C-20位的葡萄糖均生成人参皂苷Rh1，人参皂苷Rf通过水解C-6位的葡萄糖亦生成Rh1；Rh1继续再水解C-6位的葡萄糖生成PPT[3,4]。人参皂苷Re、人参皂苷Rg2和人参皂苷Rh1作为人参三醇组皂苷的主要成分，又是人参三醇组皂苷水解制备PPT的重要原料药以及中间体成分，因此选择测定人参三醇组皂苷的人参皂苷Re、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rh1以及PPT的含量作为控制人参三醇组皂苷原料质量的指标成分。

图1 人参三醇组皂苷结构图Fig.1 The structure diagrams of the protopanaxtriol saponins

研究发现，PPT具有较好地改善心肌细胞损伤的功效，可能是治疗心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI）的一个有效的单体药物，其作用机制主要与其抗氧化能力以及抗细胞凋亡的能力有关[5]；PPT还具有调节代谢紊乱和抑制脂质合成作用[6]，在多种肿瘤中发挥抗肿瘤作用[7]。拟对PPT研究开发成治疗心肌缺血的新药，而人参三醇组皂苷原料是制备PPT的重要来源，建立人参三醇组皂苷原料的质量标准可以在源头上控制PPT的质量，因此，建立人参三醇组皂苷原料的质量标准是非常有必要的。

本研究建立了HPLC法同时测定人参三醇组皂苷Re、Rg2、Rh1及PPT的含量[8-10]，对人参三醇组皂苷进行性状和薄层鉴别[11-14]并建立了指纹图谱[15-18]，为人参三醇组皂苷质量标准的初步建立提供了一定的参考依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

人参茎叶总皂苷（含量为37%）（购于吉林瑞隆药业有限公司，批号：200801）；人参皂苷Re、Rg2、Rh1和PPT标准品（自制），含量均在98%以上；95%乙醇；甲醇和乙腈为色谱纯，水为纯净水，其余试剂为分析纯。

1.2 设备

Acchrom高效液相色谱仪（华谱新创科技有限公司）；旋转蒸发器XD-2000A（上海贤德实验仪器有限公司）；恒温浴锅（上海豫康科教仪器设备有限公司）；DLSB-2L/-20低温冷却液循环泵（长春吉豫科教仪器设备有限公司）；GZX-9076 MBE数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；PTX-FA210S电子天平[华志（福建）电子科技有限公司]。

2 实验与结果

2.1 人参三醇组皂苷的制备工艺

取人参茎叶总皂苷适量用水使其完全溶解，上AB-8大孔树脂至完全吸附，然后依次用30%、40%、80%和90%的乙醇溶液洗脱，收集30%和40%的乙醇溶液洗脱，合并，回收溶剂，烘干，得人参三醇组皂苷，标号第1批。

取人参茎叶总皂苷10 g，溶于100 mL 95%乙醇中，滤过得滤液（溶液A）；另取氢氧化钠2.5 g，溶于7.5mL水中，充分溶解后向其中加入95%乙醇500mL，得0.5%（W/V）氢氧化钠乙醇溶液（溶液B），不断搅拌下，将溶液B缓慢加到溶液A中，可见絮状沉淀生成，室温静止24 h，减压过滤，收集滤液，回收溶剂，烘干，得到人参三醇组皂苷，标号第2批，平行制备得第3批、第4批[19]。

取人参茎叶总皂苷3.0 kg，加入95%乙醇5 L，水浴80℃溶解，得A液；取160 g NaOH，溶于250 mL水中，再加入18 L乙醇，混匀，得B液；将B液在搅拌下缓慢加入A液中，逐渐有沉淀析出，静止过夜；过滤，收取滤液部分，80℃烘干，粉碎，得人参三醇组皂苷，标号第5批。平行制备得第6批、第7批、第8批、第9批、第10批。

2.2 性状鉴别

取第1批、第2批、第5批的人参三醇组皂苷粉末适量进行观察鉴别[20]，其性状鉴别结果，见表1和图2。

表1 人参三醇组皂苷性状鉴别结果（n=3）Table 1 Identification results of protopanaxtriol saponins(n=3)

图2 人参三醇组皂苷粉末Fig.2 The powder of the protopanaxtriol saponins

根据3批人参三醇组皂苷粉末的性状结果，规定本品为淡黄色或黄色粉末，气微，味苦。

2.3 薄层鉴别

取本品粉末约0.05 g，加甲醇制成1mL，使其充分溶解，作为供试品溶液。另取人参皂苷Re、Rg2、Rf、Rh1和PPT标准品适量，用甲醇制成每1mL含有2mg的溶液作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验[21]吸取上述溶液各1~2L，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（2:2:4:1）常温放置的下层溶液为展开剂展开，取出，晾干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，分别显相同颜色的斑点，结果见图3。

图3 薄层色谱鉴别结果Fig.3 The TLC identification results

2.4 含量测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18（250 mm4.6 mm,5m）；流动相为乙腈（A）水（B），梯度洗脱（程序见表2）；检测波长：203 nm；柱温：30℃；体积流量：1.0mL/min；进样量：10L。

表2 梯度洗脱程序Table 2 The gradient elution program

2.4.2 溶液的制备

2.4.2.1 混合对照品溶液的制备取标准品人参皂苷Re、Rg2、Rh1及PPT标准品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含人参皂苷Re 0.66 mg、Rg20.7 mg、Rh10.26 mg和PPT 0.36 mg的混合对照品溶液。

2.4.2.2 供试品溶液按“2.1”项下方法制备人参三醇组皂苷粉末，取粉末适量，精密称定，用甲醇溶解，并转移到10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得供试品溶液。

图4 高效液相色谱图Fig.4 High performance liquid chromatogram

2.4.5 精密度的考察取同一供试品（第5批）溶液适量，按“2.4.1”项下的色谱条件重复进样5次，记录峰面积。结果，人参皂苷Re、Rg2、Rh1和PPT的RSD分别为1.76%、2.60%、2.21%和0.62%（n=5），表明精密度较好。

2.4.6 稳定性的考察取样品（第5批）适量，按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，分别于放置0 h、4 h、8 h、12 h、24 h和48 h时按照“2.4.1”项下的色谱条件进样测定并记录峰面积。结果，人参皂苷Re、Rg2、Rh1和PPT的RSD分别为2.87%、2.38%、1.27%和1.96%（n=6）。这表明供试品溶液在48 h内稳定性较好。

2.4.7 重复性试验取样品（第5批）适量，共6份，按“2.4.4”项下方法制备供试品溶液，再按“2.4.1”项下色谱条件测定，记录峰面积，并计算样品含量。结果，人参皂苷Re、Rg2、Rh1和PPT的含量分别为209.37mg/g、8.59 mg/g、2.72 mg/g和1.39 mg/g，RSD分别为2.12%、2.20%、2.35%和3.85%（n=5）。方法重现性较好。

2.4.8 加样回收率试验 按照“2.4.3”项下操作制备混合对照品溶液，混合对照品溶液中人参皂苷浓度分别为Re 0.66 mg/mL、Rg20.7 mg/mL、Rh10.26 mg/mL和PPT 0.36 mg/mL。精密称取已知含量的样品（第5批）6份，每份约0.05 g，精密称定，分别精密加入上述混合对照品溶液100L，定容至10mL，按照“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率，结果见表3。

表3 加样回收率试验结果（n=6）Table 3 The experimental results of the sample recovery rates(n=6)

2.4.9 样品含量测定取“2.1”项下制备的第1批、第2批、第5批以及第8批约0.05 g，按“2.4.4”项下方法制备供试品溶液，并按照“2.4.1”项下的色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果如表4。

表4 样品含量测定结果Table 4 The sample contents of the determination results

2.5 指纹图谱的建立与分析

2.5.1 指纹图谱的建立与共有峰的确定取10批的人参三醇组皂苷粉末适量，按照“2.4.2.2”项下制备供试品溶液，按照“2.4.1”项下的色谱条件进样分析，记录样品的色谱图并导出指纹图谱，将这10批人参三醇组皂苷的指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件中，以编号为S10的指纹图谱为参照图谱，时间窗宽度设置为0.10，经多点校正，自动匹配，生成人参三醇组皂苷样品粉末的叠加图谱见图5，以平均数法生成人参三醇组皂苷的对照图谱见图6。共确定17个共有峰，通过与对照品图谱对比可知，1为人参皂苷Re，3为人参皂苷Rg2，5为人参皂苷Rh1，17为PPT，10批人参三醇组皂苷指纹图谱的共有峰的相对保留时间和峰面积的RSD分别为0.01%~1.3%和9.48%~142.08%，这说明10批的人参三醇组皂苷的成分类似，各成分间含量差异较大[22,23]。

图5 10批人参三醇组皂苷的HPLC指纹图谱Fig.5 The HPLC fingerprints for the 10 batches of protopanaxtriol saponins

图6 人参三醇组皂苷的对照指纹图谱Fig.6 The control fingerprint of protopanaxtriol saponins

2.5.2 相似度评价选择“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件中的分析检验对10批人参三醇组皂苷样品粉末的指纹图谱进行相似度计算，结果见表5。观察表5可知，人参三醇组皂苷的指纹图谱与对照品的指纹图谱相似度范围为0.829~0.998，其中第1批（S1）与其他9批相比，相似度均小于0.9；第2批（S2）、第3批（S3）、第4批（S4）、第5批（S5）与第9批（S9）、第10批（S10）相比，相似度也小于0.9，而与第6批（S6）、第7批（S7）、第8批（S8）样品相比相似度均大于0.9；第9批、第10批样品与第6批、第7批、第8批样品相比，相似度均大于0.9。这表明第1批样品与其他9批样品相似度较低，第2批、第3批、第4批、第5批与第9批、第10批相比相似度较低，而第6批、第7批、第8批与第2批、第3批、第4批、第5批以及第9批、第10批的相似度较好，化学成分相似。

表5 10批人参三醇组皂苷的相似度结果Table 5 The similarity results for the 10 batches of protopanaxtriol saponins

2.5.3 聚类分析使用SPSS 25.0软件，以人参三醇组皂苷的指纹图谱中17个共有峰的峰面积为变量，聚类方法采用平均组间联接，区间平均欧氏距离测量绘制树状图[24]，如图7，结果表明，当欧氏距离为5时，10批样品被分为4类，第1批为一类；第2批为一类；第3批、第4批为一类；第5批、第6批、第7批、第8批、第9批以及第10批为一类；当欧氏距离为10时，10批样品被分为3类，第2批为一类；第1批、第3批和第4批为一类；第5批、第6批、第7批、第8批、第9批以及第10批为一类；当欧氏距离为15时，10批样品被分为2类，第1批、第2批、第3批和第4批为一类；第5批、第6批、第7批、第8批、第9批以及第10批为一类。这种分类方式可能与其制备方式有关，其中当欧式距离为5、10、15时，第5批、第6批、第7批、第8批、第9批以及第10批均为一类，这说明第3种制备方法中人参三醇组皂苷的含量差异较小，制备方法稳定。从工艺稳定性上建议采用第3种制备方法制备人参三醇组皂苷。

图7 10批人参三醇组皂苷的聚类分析结果图Fig.7 The cluster analysis results for the 10 batches of protopanaxtriol saponins

3 讨论与结论

3.1 讨论

通过对比4批样品可知，“2.1”项下的3种方法制备的人参三醇组皂苷中的人参皂苷Re、Rg2、Rh1及PPT含量相差较大，且第3种方法具有节约时间，操作简单的优点，工业上宜采用第3种方法制备人参三醇组皂苷。

已有文献采用的HPLC法同时测定人参皂苷Re以及其他皂苷的方法梯度复杂，检测时间长，且测定的皂苷多以总皂苷为主[25-28]。本研究建立了HPLC法测定人参茎叶人参三醇组皂苷Re、Rg2、Rh1以及PPT的含量方法，在保证分离度以及不影响检测结果的前提下，克服了已有检测方法检测时间长的缺点，提高了检测效率，且人参皂苷Re、Rg2、Rh1以及PPT既是人参三醇组皂苷的重要组成成分，亦是制备PPT的重要原料药及中间体，选择测定这4种皂苷对于制定人参三醇组皂苷质量标准有着重要的意义。

3.2 结论

本研究对不同方法制备的人参三醇组皂苷进行了性状鉴别、显微鉴别以及含量测定，并建立了人参三醇组皂苷的指纹图谱。建立了HPLC法同时测定人参三醇组皂苷中的人参皂苷Re、Rg2、Rh1及PPT含量的方法，可为人参三醇组皂苷质量标准的建立提供科学依据。

性状鉴别结果表明人参三醇组皂苷是淡黄色或黄色粉末，气微，味苦；薄层鉴别色谱结果表明人参三醇组皂苷主要含有人参皂苷Re、Rg2、Rf、Rh1及PPT，供试品色谱图与对照品色谱图在相同的位置上显示相同的斑点。本实验建立了同时测定人参三醇组皂苷中Re、Rg2、Rh1及PPT含量的HPLC法，该方法操作简单，分离度好，通过该方法测定可知，人参三醇组皂苷中人参皂苷含量分别为Re 179.76 mg/g、Rg211.57 mg/g、Rh13.09 mg/g和PPT 1.60 mg/g。这表明人参皂苷Re是人参三醇组皂苷中含量最高的成分；10批的人参三醇组皂苷样品共标出17个共有峰，通过与对照品图谱对比可确认4个有效成分，分别为人参皂苷Re、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rh1以及PPT，相似度分析结果表明同一制备方法得到的样品相似度较高，聚类分析将10批样品分为4类，分别对应其不同的制备方法。

目前尚未见国内（外）文献报道人参三醇组皂苷质量标准的研究，本研究建立了人参茎叶人参三醇组皂苷的性状鉴别、薄层鉴别、含量测定以及指纹图谱，为完善人参三醇组皂苷的质量标准，仍需要对人参三醇组皂苷进行更深入的研究与总结。