不同营养和环境因子对高大环柄菇菌丝生长的影响

刘明广，李 琳

(阜阳职业技术学院 生化工程系,安徽 阜阳 236031)

高大环柄菇(Macrotepiotaprocera)又称高脚环柄菇、高柄环菇、棉花菇等,国外别称阳伞蘑菇,在分类上属于担子菌门(Basidiomycota)、伞菌亚门(Agaricomycoina)、伞菌纲(Agaricomycetes)、伞菌亚纲(Agaricomycetidae)、伞菌目(Agaricales)、伞菌科(Agaricaceae)、大环柄菇属(Macrolepiota)[1],是亚热带地区的一种大型腐生菌,也是一种土生的珍惜食用菌[2],其籽实体高大,质地脆嫩，风味宜人,是很受欢迎的野生食用菌.高大环柄菇广泛分布在温带、亚热带地区，如英国南部、爱尔兰、波兰、塞尔维亚、欧洲与美国，在英国北部与苏格兰侧多分布于有遮蔽的海岸区域.我国的高大环柄菇主要分布在辽宁、广东、河南、江苏、海南、福建、山东、浙江、广西、湖南、四川、安徽、黑龙江、吉林等地[3].高大环柄菇含有丰富的维生素、矿物质、氨基酸、蛋白质等多种营养成分,尤以人体必需的8种氨基酸含量高而著称[4]，具有较好的食用价值.在药用方面，高大环柄菇含有木瓜蛋白酶、豆荚蛋白和多种组织蛋白酶等化学成分,这些成分具有半胱氨酸蛋白酶拮抗作用[5].最新研究发现脱皮大环柄菇挥发油化学成分独特,含1种醇类化合物、1种酯类化合物和7种酮类化合物,丙酮粗提物因含有生物碱、萜类、甾醇等活性成分，且具有有效的抗氧化活性[6].因此，开展高大环柄菇开发研究具有重要的意义.

1 材料与方法

1.1 试验材料

菌种:高大环柄菇由北京市食用菌工程技术研究中心提供,编号为京zb2115036.

仪器：LS-75HD立式压力蒸汽灭菌锅(江阴滨江医疗设备有限公司),HFsafe1500LC生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司),SPX-328生化培养箱(宁波江南仪器厂)、HYC-198S医用冷藏箱(青岛海尔科技有限公司),BSM-120.4电子天平(上海卓精电子科技有限公司).碳源试验的基础培养基:磷酸二氢钾0.5 g,硫酸镁0.5 g,酵母浸粉2.0 g,琼脂粉19.0 g,蒸馏水1 L;氮源试验基础培养基:磷酸二氢钾0.5 g,硫酸镁0.5 g,葡萄糖18.0 g,琼脂粉19.0 g,蒸馏水1 L;无机盐试验的基础培养基:酵母浸粉2 g,葡萄糖18 g,琼脂粉19 g,维生素B1100 mg,蒸馏水1 L;生长因子试验的基础培养基:磷酸二氢钾0.5 g,硫酸镁0.5 g,酵母浸粉2.0 g,葡萄糖18.0 g,琼脂粉19.0 g,蒸馏水1 L;温度试验培养基配方：PDA培养基1 L加入蛋白胨5.0 g,硫酸镁 0.5 g;菌种活化培养基为PDA培养基.

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化

提前10天将高大环柄菇菌种接种在PDA培养基进行活化备用.

1.2.2 碳源试验设计

在碳源基础培养基上,设置蔗糖(18 g/L)、乳糖(18 g/L)、木糖(18 g/L)、麦芽糖(18 g/L)、果糖(18 g/L)、葡萄糖(18 g/L)和对照组(CK)7 个处理，用直径为5 mm的无菌打孔器取高大环柄菇平板边缘菌落接入不同碳源的培养皿中央，每个处理接种5个培养皿，25℃恒温培养.培养7天后,记录菌丝生长长势和菌落特征,用十字划线法量取菌落直径.

1.2.3 氮源试验设计

在氮源基础培养上,设置6 个氮源处理,即酵母浸粉(2 g/L)、氯化铵(2 g/L)、豆饼粉(2 g/L)、蛋白胨(2 g/L)、牛肉膏(2 g/L)和对照组(CK),每个处理接种5个培养皿，接种、培养和数据采集方法同1.2.2 .

1.2.4 无机盐试验设计

在无机盐基础培养基上,设置硫酸镁(0.5 g/L)、硝酸铵(0.5 g/L)、磷酸二氢钾(0.5 g/L)、碳酸钙(0.5 g/L)、氯化铵(0.5 g/L)和对照组(CK)6个处理，每个处理接种5个培养皿，接种、培养和数据采集方法同1.2.2 .

1.2.5 生长因子试验设计

在生长因子基础培养基上,设置维生素B6(0.01 g/L)、维生素B2(0.01 g/L)、维生素B1(0.01 g/L)、肌醇(0.01 g/L)和对照组(CK)6个处理，每个处理接种5个培养皿,接种、培养和数据采集方法同1.2.2 .

1.2.6 pH试验设计

PDA培养基灭菌后,用0.2 mol/L Na2HPO4·2H2O和0.1 mol/L柠檬酸调配成7个pH梯度：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8,每个梯度接种5个培养皿,接种、培养和数据采集方法同1.2.2 .

1.2.7 温度试验设计

在温度试验培养基上,设置6个温度梯度,每一温度梯度接种5个培养皿.接种后分别放在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃的生化培养箱进行培养,接种和数据采集方法同1.2.2 .

1.2.8 正交试验设计

从氮源、碳源、无机盐和pH值四个因素中分别选出影响度排在前三的单因素组建4因素3水平试验的正交培养基组合,列出正交试验直观分析表,组合的顺序用试验号表示，每个组合接种5个培养皿,接种、培养和数据采集方法同1.2.2 .

1.2.9 数据处理

数据用SPSS 19.0软件处理.

2 结果与分析

2.1 不同碳源对高大环柄菇菌丝生长的影响

从表1可以看出高大环柄菇在6种不同碳源培养基上都能生长，在以蔗糖为碳源的培养基上菌丝生长速度最快,生长长势最好,菌丝白色平贴;在以麦芽糖为碳源的培养基上菌丝白色平贴,但其生长速度与蔗糖的差异显著，在以乳糖为碳源的培养基上菌丝生长缓慢,生长长势也最差,其生长速度比对照组慢.说明不同碳源对高大环柄菇的菌丝生长速度有重要影响.

表1 不同碳源对高大环柄菇菌丝生长的影响

2.2 不同氮源对高大环柄菇菌丝生长的影响

从表2可以看出高大环柄菇在5种不同氮源培养基上都能生长,与对照组相比添加氮源能促进菌丝的生长,在酵母浸粉培养基上生长速度最快,生长长势最好,菌落特征也好,其次是在牛肉膏培养基上,而在豆饼粉培养基上生长是最差,生长速度也最慢.

表2 不同氮源对高大环柄菇菌丝生长的影响

2.3 不同无机盐对高大环柄菇菌丝生长的影响

从表3可以看出,在5个不同处理的无机盐培养基上高大环柄菇都能生长,在碳酸钙培养基上菌丝生长长势最好,生长速度也最快,其次是在磷酸二氢钾培养基里，在对照组培养基里菌丝生长长势最差,生长速度最慢,说明添加适量的这几种无机盐能促进菌丝生长.

表3 不同无机盐对高大环柄菇菌丝生长的影响

2.4 不同生长因子对高大环柄菇菌丝生长的影响

从表4可以看出,高大环柄菇在维生素B2培养基上生长长势最好,生长速度最快,其次是在空白对照培养基上,在其他培养基上生长速度变慢,生长长势变差，说明其他几种生长因子不适合该菌株生长,表现出抑制该菌株生长.

2.5 不同pH值对高大环柄菇菌丝生长的影响

从图1可以看出在pH值从5.0到6.5的培养基里菌丝生长速度逐步加快,在pH值为6.5的培养基里菌丝生长速度达到最大,生长长势也最好.pH值从6.5到8.0的培养基里菌丝生长速度逐步变慢，pH值为6与6.5的菌丝生长速度显著,pH值为6.5与7.0的菌丝生长速度也显著,表明该菌株的最适生长pH值为6.5.同大多数食用菌一样,该菌株喜欢中性略偏酸性的环境,不同pH值条件下菌丝生长速度不同,但菌落颜色等特征差别不大(表5),说明pH值影响该菌株的生长速度,对菌落特征影响不大.

图1 不同pH对高大环柄菇菌丝生长的影响

表5 不同pH对高大环柄菇菌丝生长的影响

2.6 不同温度对高大环柄菇菌丝生长的影响

在10℃菌丝生长非常缓慢,从10℃到25℃菌丝生长速度逐渐加快,在25℃菌丝生长速度达到最快,生长长势也最好,20℃和25℃条件下菌丝生长速度差异显著,25℃和30℃条件下菌丝生长速度差异也显著(表6),说明25℃是该菌株菌丝的最适温度.随着温度的升高，菌丝生长速度很快下降，35℃菌丝停止生长(图2)，说明温度对该株高大环柄菇菌丝生长速度影响明显.

图2 不同温度对高大环柄菇菌丝生长的影响

表6 不同温度对高大环柄菇菌丝生长的影响

2.7 正交试验结果直观分析

从高大环柄菇菌丝生长的4因素3水平正交试验(表7)可以看出,1号、2号、5号和8号的菌丝生长长势最好，4号和8号菌丝生长长势一般，3号、6号和9号菌丝生长长势最差.氮源对该菌株影响的极差最大,R=1.523,pH排第二，无机盐排第三,最后是碳源.综合考虑,确定了四因素的最佳配方组合,碳源 X1,氮源 X2,无机盐 X2,pH X1,即蔗糖,酵母浸粉,磷酸二氢钾,pH 6.5.

表7 高大环柄菇菌丝生长的正交试验结果

3 讨论与结论

从高大环柄菇菌丝在不同氮源的生长情况看，在蛋白胨、酵母浸粉和牛肉膏有机氮源上生长情况好于无机氮源氯化铵,可能与有机氮源中含有的微量元素、核苷酸、维生素等一些非氮成分能够促进菌丝生长有关[7].该试验中最佳氮源为酵母浸粉,而非蛋白胨,这与以往的报道结果相近[8],这是由于两者培养基的无机盐含量不同造成的.从该菌株的4因素3水平的正交结果可知,氮源对该菌株影响的极差最大,其次是pH值,再次是无机盐,最后是碳源,综合分析,确定了最佳培养配方组合为:蔗糖,酵母浸粉,磷酸二氢钾,pH 6.5,这与无机盐单因素分析结果是碳酸钙不一致，多个因素相互作用的正交试验结果有时与单因素试验结果不同,也很常见.

通过不同碳源、氮源、无机盐、生长因子、pH值和温度对该株高大环柄菇菌丝生长的影响,筛选出了菌丝生长的最适单因素培养条件和最佳培养组合条件,为该菌株的培养和驯化提供了依据.但该菌株的最佳原种配方、最佳栽培配方、最佳栽培培养基配方以及最佳育菇环境参数还不清楚,这些还有待进一步研究.