黄柏质量标准示范性研究

龙倩倩，赵小勤，代 琪，雷 蕾

(1.成都市食品药品检验研究院 国家药监局中药材质量监测评价重点实验室，四川 成都 610045；2.西南民族大学 药学院，四川 成都 610041)

《中国药典》经过历版的不断修订，目前已成为世界上质控指标最完善、检测技术最先进的中草药标准之一。但通过对比《中国药典》和《欧洲药典》《德国药品法典》发现，部分《欧洲药典》《德国药品法典》收录的中草药品种前处理相对简单，使用溶剂更环保，禁用苯、三氯甲烷等毒性较强的试剂，从而更好地保障检验人员的身体健康。

黄柏为芸香科植物黄皮树PhellodendronchinenseSchneid.的干燥树皮，入药首载于《神农本草经》，列为中品，名曰“檗木”，南北朝时期又名“黄檗”，至近代始有“黄柏”之称。黄柏具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的功效，黄柏临床应用广泛，中医药典籍中收录含黄柏的方剂众多，常用于治疗湿热泻痢、黄疸尿赤、带下阴痒、骨蒸劳热等症[1-3]。

黄柏1963年始收入《中国药典》[4]，后历版药典均有收载。《中国药典》2020年版中黄柏质量标准项目设置较完善，但存在以下不足：薄层鉴别效果较差且展开剂使用毒性较强的三氯甲烷；含量测定流动相配制较复杂且供试品处理中使用的乙腈较毒。本课题借鉴《欧洲药典》10.0版和《德国药品法典》2018年版的思维模式，对黄柏质量标准展开研究，合并黄柏两个含量测定项为一项，合并薄层鉴别和含量测定的样品前处理，简化流动相配制条件，将样品提取溶剂和薄层展开剂改为低毒试剂，从而优化了原标准，使检测变得更为简单快捷、绿色环保。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters-2998高效液相色谱仪，Waters-e2695 Photodiode Array Detector 检测器，Empower pro自动进样色谱工作站(美国Waters公司)；Anilent 1260高效液相色谱仪，Anilent 1260 DAD检测器，LC openLAB自动进样色谱工作站(美国安捷伦公司)；AUX220电子天平(日本岛津公司，1/1万)；XPE26电子天平(梅特勒-托尼多仪器有限公司，1/100万)；SK250H超声仪(250 W，53 kHz，上海科导超声仪器有限公司)；移液枪(Eppendorf，Germany)等。

1.2 试剂与药品

盐酸黄柏碱(94.9%，111895-201805)、盐酸小檗碱(85.9%，110713-202015)，黄柏对照药材(121510-201807)，对照品和对照药材均购自中国食品药品检定研究院；乙腈(色谱纯)；其余试剂(分析纯)；水(实验室自制纯净水)。

黄柏样品20批(编号：CD-1、CD-2、CD-3、CD-4、CD-5、CD-6、CD-7、CD-8、CD-9、CD-10、CD-11、CD-12、CD-13、CD-14、CD-15、CD-16、CD-17、CD-18、CD-19、CD-20)，来源信息见表1。

表1 黄柏样品来源

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 选定薄层鉴别方法 取“2.2.2”项下供试品备用溶液，作为供试品溶液。另取黄柏对照药材约1 g，同法制成对照药材溶液。再取含量测定项下盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱的混合对照品溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(参照《中国药典》2020年版通则0502)试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以无水甲酸-水-乙酸乙酯(10∶10∶80)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。其中，以苦参碱、盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱混合对照品溶液和1/4浓度的盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱混合对照品溶液对该条件进行系统适用性试验，结果表明，方法可行，薄层色谱见图1。

注：1.系统适用性试验；2.盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱混合对照；3.1/4盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱混合对照；4.黄柏对照药材；5.CD-1；6.CD-2；7.CD-3；8.CD-4；9.CD-5；10.CD-6；11.CD-7；12.CD-8；13.CD-9。

2.1.2 各薄层条件方法筛选 (1)供试品溶液制备：①按《欧洲药典》EP10.0黄连项下薄层鉴别方法处理黄柏样品，即取0.25 g黄柏粉末，加4 mL的80%甲醇溶液，超声10 min，过滤，用80%甲醇溶液2次清洗残留物，每次2 mL，合并溶液并用甲醇稀释至20 mL，作为供试品溶液1；②按《中国药典》2020年版黄柏项下薄层鉴别方法处理黄柏样品，即取本品粉末0.2 g，加1%醋酸甲醇溶液40 mL，于60℃超声处理20 min，滤过，滤液浓缩至2 mL，作为供试品溶液2；③按“2.1”选定方法处理，作为供试品溶液3。

(2)对照品溶液制备：分别取盐酸黄柏碱对照品、盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加1%盐酸甲醇溶液制成每1 mL各约含0.1 mg的对照品溶液，即得。

(3)薄层展开条件及显色条件筛选：①以三氯甲烷-甲醇-水(30∶15∶4)的下层溶液为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内展开[1]；②以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)为展开剂[6-7]；③以正丁醇-冰醋酸-水(7∶2∶5)为展开剂[8]；④以无水甲酸-水-乙酸乙酯(10∶10∶80)为展开剂。上述条件下展开后取出，晾干，再喷以稀碘化铋钾试液，置日光下检视，薄层色谱见图2。

注：1.供试品溶液1；2.供试品溶液2；3.供试品溶液3；4.盐酸小檗碱；5.盐酸黄柏碱。

由薄层色谱图可见，按《欧洲药典》EP10.0黄连项下薄层鉴别方法提取的黄柏样品，在与盐酸黄柏碱对照品相同位置无斑点，因此该提取方法不可行；按《中国药典》2020年版黄柏项下薄层鉴别方法提取的黄柏样品与选定方法效果一致，但选定方法可直接采用含量测定项下提取溶液，操作更简便。

薄层展开剂①为《中国药典》2020年版黄柏项下薄层色谱展开条件，其中三氯甲烷毒性较大，不符合欧盟环保要求；薄层展开剂④展开时间且效果优于展开剂②和③，因此选定薄层展开剂④为本标准薄层展开剂。另有文献采用乙酸乙酯-甲苯-异丙醇-甲醇-浓氨试液(6∶12∶3∶3∶1)[9]或甲苯-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨液(6∶3∶1.5∶1.5∶0.5)[10]为展开剂，但因甲苯毒性较强，故未进行相关考察。

2.2 盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱含量测定

2.2.1 色谱条件 以InerSustain C18柱(250mm×4.0 mm、5μm)为色谱柱；以1%磷酸二氢钾溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～20 min，95%～83%(A)；20～28 min，83%～50%(A)；28～33 min，50%～95%(A)；33～35 min，95%(A)；柱温：35 ℃；流速1.0 mL/min；检测波长为230 nm。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于3 000。

2.2.2 溶液的制备 (1)对照品溶液：取盐酸黄柏碱对照品、盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加1%盐酸甲醇溶液制成每1 mL约含0.1 mg的混合溶液，即得。

(2)供试品溶液：取本品细粉约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1%盐酸甲醇溶液50 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用1%盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2 mL(其余滤液备用)，置10 mL量瓶中，加1%盐酸甲醇溶液至刻度，摇匀，即得。对照品和供试品溶液色谱见图3。

注：1.盐酸黄柏碱；2.盐酸小檗碱。(A)和供试品溶液(B)HPLC 图。

2.2.3 线性关系考察 精密称取盐酸黄柏碱对照品22.321 mg，置50 mL量瓶中，加1%磷酸二氢钾溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液母液。将母液分别稀释至8个不同浓度溶液，按“2.2.1”项色谱条件进样，测定峰面积，计算线性关系。以进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积(A)为纵坐标(Y)进行线性回归，得回归方程：y=1 587 608.840 7-20 381.838 4，R2=0.999 7。结果表明，盐酸黄柏碱进样量在0.021 2～4.236 5μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

精密称取盐酸小檗碱对照品102.260 mg，置50 mL量瓶中，加1%磷酸二氢钾溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液母液。将母液分别稀释至8个不同浓度溶液，按“2.2.1”项色谱条件进样，测定峰面积，计算线性关系。以进样量(μg)为横坐标(X)，峰面积(A)为纵坐标(Y)进行线性回归，得回归方程：y=3 687 823.565 6x+50 162.086 6，R2=0.999 6。结果表明，盐酸小檗碱进样量在0.175 7μg～17.568 3μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.4 稳定性试验 取同一批样品(CD-3)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、16、20、24 h测定盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱的峰面积，RSD分别为1.88%、1.47%；另取盐酸黄柏碱对照品溶液(0.098 53 mg/mL)，盐酸小檗碱对照品溶液(0.090 26 mg/mL)分别于0、2、4、8、12、16、20、24 h测定盐酸黄柏碱、盐酸小檗碱的峰面积，RSD分别为0.88%、1.43%。结果表明供试品溶液和对照品溶液在24 h内稳定。

2.2.5 精密度试验 精密吸取同一对照品溶液和供试品溶液(“2.2.4”项下对照品溶液和供试品溶液)重复进样6次，进样10μL，测定峰面积，结果显示RSD均<1.0%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验 按拟定的含量测定方法，对同一批样品(CD-3)，按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，测定含量，RSD分别为1.26%、1.98%，结果表明本方法有较好的重复性。

2.2.7 准确度试验 取已知含量(盐酸黄柏碱为6.143 4 mg/g，盐酸小檗碱为55.457 9 mg/g)的黄柏供试品(CD-3)9份，每份约0.5 g，精密称定，分成3组，每组3份，3组分别按照供试品中盐酸黄柏碱含有量的50%、100%、150%加入盐酸黄柏碱对照品溶液(浓度为0.423 7 mg/mL)4 mL、8 mL、12 mL；按3组供试品中盐酸小檗碱含有量的50%、100%、150%加入盐酸小檗碱对照品溶液(浓度为1.756 8 mg/mL)8 mL、16 mL、24 mL。按拟定的方法制成供试品溶液，按“2.2.1”项色谱条件进样，测定峰面积，分别计算回收率，结果盐酸黄柏碱的回收范围为100.54%～103.20%，盐酸小檗碱的回收范围为97.68%～100.50%，RSD值均小于2%。结果见表2、表3，试验结果表明本方法准确度良好。

表2 盐酸黄柏碱准确度实验结果 (n=3)

表3 盐酸小檗碱准确度实验结果 (n=3)

2.2.8 样品含量测定 取表1中的黄柏药材、饮片样品适量，每个样品平行3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，计算各批样品中盐酸黄柏碱和盐酸小檗碱的含量，结果见表4。

表4 样品盐酸黄柏碱和盐酸小檗碱含量测定结果 (n=3)

2.3 其他检验项目

经研究，《中国药典》2020版一部黄柏项下性状及显微鉴别描述准确，水分、灰分、浸出物的规定合理。20批黄柏样品水分、灰分、浸出物见表5。

表5 样品水分、总灰分、浸出物含量测定结果 (n=3)

3 讨论

3.1 薄层显色条件的考察

经考察发现，选用三批样品(CD-1、CD-2、CD-3)采用本标准选定条件提取供试品溶液，以无水甲酸-水-乙酸乙酯(10∶10∶80)展开后，晾干，立即置紫外光灯(365 nm)下检视，盐酸黄柏碱无斑点检出，但放置12 h后，再置紫外光灯(365 nm)下检视，盐酸黄柏碱有明显斑点检出，因此，也可选用展开后，晾干，放置12 h后，置紫外光灯(365 nm)下检视为薄层显色条件，该方法不需配制显色剂，更为经济环保，但考虑到检品通常具有时效性，本标准未采用该方法，薄层图见图4。

注：1.CD-1；2.CD-2；3.CD-3；4.盐酸黄柏碱；5.盐酸小檗碱

3.2 提取溶媒的选择

参考黄柏质量标准含量测定相关文献[11-14]，共考察了6种溶媒：乙腈-0.1%磷酸溶液(50∶50)(每100 mL加十二烷基磺酸钠0.1 g)、乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 mL加十二烷基磺酸钠0.2 g)(36∶64)、1%盐酸甲醇溶液、1%醋酸甲醇溶液、0.2%盐酸甲醇溶液、0.2%醋酸甲醇溶液，结果显示，盐酸黄柏碱溶媒2和溶媒3提取效果较好，盐酸小檗碱溶媒1和溶媒3提取效果较好，但1和2两种溶媒提取均配制较繁琐且乙腈毒性较大，溶媒3毒性较低且配制简单，且提取效果与溶媒1和溶媒2差别不大，因此，本标准选定溶媒3为提取溶剂。

3.3 流动相选择

《中国药典》2020版黄柏项下[1]，以乙腈-0.1%磷酸溶液(50∶50)(每100 mL加十二烷基磺酸钠0.1 g)测定盐酸小檗碱，乙腈-0.1%磷酸溶液(每100 mL加十二烷基磺酸钠0.2 g)(36∶64)测定盐酸黄柏碱，两种流动相配制均较繁琐。查阅相关文献[8-14]，黄柏含量测定多数均采用乙腈-盐溶液为流动相，配制也较复杂。也有提到采用乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相[15]，但经试验峰形较差。最终参考《欧洲药典》EP 10.0黄连含量测定项下方法[5]，为保护色谱柱，经试验在保证峰形和分离度不变的前提下，进一步降低盐溶液浓度，最终以乙腈-1%磷酸二氢钾溶液为流动相。

4 结论

本课题调研多篇文献，尝试从以人为本的角度，在保证检测效果的前提下，尽可能为检验者提供更简单、快捷、绿色的检测标准。目前《中国药典》项下中药材和中成药涉及的仪器和技术越来越先进，质控体系也越来越完善，但因历史原因，前期起草的部分标准可能会存在一些可提高的地方。本研究参考《中国药典》项下黄柏标准，借鉴《欧洲药典》和《德国药品法典》思维模式，制定黄柏新标准时尽可能绿色简单，希望能为大家在以后制定标准时提供参考。