黄芩-连翘药对治疗重症肺炎的作用机制探讨*

戴和森，周大勇，刘颖

1 安徽中医药大学研究生院 安徽合肥 230038

2 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230038

重症肺炎是一类由社区获得性肺炎或医院获得性肺炎进行性发展而来，最终导致以肺部损害为主的多脏器功能衰竭的呼吸系统危重疾病[1-2]，患者一般表现为高热、意识模糊、低血压等，病情严重时常伴有脓毒症休克、呼吸衰竭、多器官功能障碍等危重症状。作为ICU常见的危重疾病，对重症肺炎主要现代医学以抗感染、营养支持、机械通气等对症治疗为主[3]，但也产生了抗生素耐药、菌群失调、免疫功能低下等副作用，且病死率仍居高不下。重症肺炎属于中医学“风温肺热病”“喘证”，中西医结合治疗对于缓解重症肺炎并发症、提高患者生存质量、减少患者治疗肺炎等方面存在巨大优势[4]。黄芩味苦， 性寒，有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎的功效，现代药理学研究表明，黄芩中含有的黄酮类成分具有很好的解热、抗炎、抗菌抗病毒、免疫调节功效[5-8]。连翘味苦，性微寒，具有清热解毒、消肿散结、疏散风热等功效，现代药理研究表明，连翘中主要成分具有很好的抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化等功效[9-11]。黄芩-连翘配伍在中药及中成药处方中都有体现，如葛根芩连汤、双黄连口服液、牛黄上清丸等，也是治疗重症肺炎的常用药物组合。

与西药单成分、单靶点不同，中药作用往往是多成分、多靶点、调节方式多样，所以采用西药研究思维很难科学地解释中药的药效物质基础和组方规律[12]。网络药理学旨在从相互关联及关联强度的角度研究问题[13]，利用网络药理学对中药处方治疗疾病的研究有独特的优势和巨大潜力。为更全面地探讨黄芩-连翘药对治疗重症肺炎的作用机制，本研究采用网络药理学方法构建、分析药物-基因-疾病网络和靶点蛋白交互作用（protein-protein interaction， PPI）网络。利用分子对接方法验证药物活性成分与重症肺炎相关靶点的结合活性，验证治疗重症肺炎的可能性，为后续深入研究提供参考依据。

材料与方法

1 黄芩-连翘成分及作用靶点筛选

利用中药系统药理学数据库与分析平台[14]（TCMSP，https：//tcmspw.com）对黄芩、连翘的主要化学成分及其药物动力学性质进行评估。 “Herb Name”以“黄芩”“连翘”作为关键词，选取口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30% 和类药性（drug likeness，DL）≥0.18的化学成分作为候选活性成分。再通过TCMSP数据库得到药物的潜在靶点，借助蛋白质数据库（Uniprot，https：//www.uniprot.org/），限定物种为“Homo sapiens”，将所得的靶点信息标准化，获取靶点的基因名。

2 疾病靶点和药物作用靶点

利 用 GeneCards数 据 库（https：//www.genecards.org/）、OMIM 数据库（https：//omim.org/）检索关键词为“Severe pneumonia”，删除重复靶点后获得重症肺炎相关靶点。运用Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在线作图工具绘制药物-疾病靶点的韦恩图，取交集作为潜在治疗靶点。

3 药物-成分-靶点网络构建

将黄芩-连翘药对筛选出的候选化合物及药物与疾病共同靶点上传至Cytoscape3.7.2软件，构建复药物-成分-靶点网络，并对网络的拓扑属性进行分析，预测中药主要活性成分。

4 靶点蛋白互作网络构建

筛选得到共同靶点导入到String数据库（https：//www.string-db.org/）中，设定物种为“homosapiens”，最低相互作用得分＞0.4，获取蛋白相互作用TSV文件，将文件导入Cytoscape3.7.2，绘制蛋白相互作用网络图，并通过网络拓扑值选出核心靶点。

5 基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析

利用R软件Bioconductor软件包中“org.Hs.eg.db”功能，将交集靶点转换成enterzID。然后利用“cluster Profiler”包，导入转换的 enterzID，以P-value＜0.05为条件对交集基因进行基因本体（geneontology， GO）功能和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，分析黄芩-连翘治疗重症肺炎的生物学过程（BP，Biological Process）、组成（CC， Cellular Component）、分子功能（MF， Molecular Function）和信号通路，并将富集结果前15位以气泡图形式可视化呈现。

6 成分-靶点分子对接验证

通过化合物商业数据库（ZINC，http：//zinc.docking.org/）检索核心活性成分pdb格式作为受体，通过蛋白质数据库（PDB，https：//www.rcsb.org/）获取关键靶点的pdb格式文件作为配体，使用Autodock 1.5.6软件对受体和配体分子进行去水、加氢处理，计算受体与配体结合能，使用R软件“pheatmap”包对结合能以可视化呈现，使用Pymol软件对配体和受体结合可视化呈现。

结 果

1 中药的活性成分和潜在靶点

通过TCMSP数据库筛选共得到黄芩中的活性成分39个，潜在靶点118个；连翘活性成分23个，潜在靶点213个。

2 疾病靶点和中药作用靶点

通过GeneCards数据库、OMIM数据库，获取重症肺炎相关靶点2477个。将中药靶点和重症肺炎相关靶点导入Venny2.1在线作图工具，获得中药-疾病靶点的韦恩图，见图1，由图可知，黄芩、连翘之间相同靶点为90个，黄芩与重症肺炎有78个交集靶点，连翘与重症肺炎有149个交集靶点。

图1 中药-疾病靶点韦恩图

3 药物-成分-靶点网络

建立中药活性成分及靶点信息的Network文件和Type文件，导入Cytoscape3.7.2软件构建药物-成分-靶点网络，见图2，可得到一张Nodes为212（其中中药成分节点51个）、Edges为1701的网络。通过网络拓扑属性分析，见表1，中药成分网络度值（Degree）前10位成分分别为：槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）、汉黄芩素（wogonin）、黄岑黄素（baicalein）、beta- 谷甾醇（beta-sitosterol）、金合欢素（acacetin）、苏荠苎黄酮（Moslosooflavone）、千层纸素 A（oroxylin a）、黄芩黄酮（rivularin），这些成分与重症肺炎的交集靶点较多，推测这些成分可能为重症肺炎治疗的关键成分。

表1 中药成分度值前15

图2 药物-成分-靶点网络图

4 PPI蛋白互作网络

将160个共同靶点录入String数据库，获取蛋白之间相互关系网络数据TSV文件，将文件导入cytoscape3.7.2软件，构建PPI蛋白互作网络，并根据通过拓扑属性分析网络度值（Degree）、介度中心性（Betweenness Centrality，BC）和紧密中心性（Closeness Centrality，CC），进而筛选出核心靶点，见图3。节点网络度值前15如表2所示，其中AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF节点度值较高，推测这些靶点可能是黄芩-连翘治疗重症肺炎的关键靶点。

表2 PPI网络度值前15

图3 黄芩-连翘治疗重症肺炎PPI网络图

5 潜在靶点富集分析

将160个潜在靶点经R语言运行后共获得2702条GO富集功能，其中2473个生物过程，见图4-A，主要与对氧化应激反应、对脂多糖反应、对细菌来源反应、对药物反应等相关。302个细胞组分，见图4-B，主要包括膜筏、膜微孔、膜区、囊泡腔等。57个分子功能，见图4-C，主要涉及信号受体激活剂、受体配体活性、细胞因子受体结合等。KEGG分析共富集于244条信号通路，见图4-D，主要与白细胞介素-17信号通路（IL-17 signaling pathway）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、C型凝集素受体信号通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、病毒感染、癌症通路等途径相关。

图4 GO生物学过程（A）、细胞组分（B）、分子功能（C）和KEGG富集分析（D）

6 分子对接结果

选取黄芩-连翘治疗重症肺炎网络度值前10位中药成分：槲皮素、木犀草素、山奈酚、汉黄芩素、黄岑黄素、beta-谷甾醇、金合欢素、苏荠苎黄酮、千层纸素A、黄芩黄酮，与PPI网络图度值前5的靶点进行对接，分子对接靶点为： AKT1（PDB ID：1UNQ）、IL6（PDB ID：4O9H）、TP53（PDB ID：1AIE）、VEGFA（PDB ID：1MKK）、TNF（PDB ID：5UUI），对接结果见图 5。

一般认为结合能＜-4.25 kcal·mol-1提示配体与受体有一定的结合活性，＜-5.0 kcal·mol-1有较好的结合活性，＜-7.0 kcal·mol-1有强烈的结合活性[15]。结合图5可知，所有成分与靶点结合能均＜-5.0 kcal·mol-1，其中beta-谷甾醇除IL-6外与靶点结合能 ＜-7.0 kcal·mol-1，结合能强烈。用 PyMOL 软件以熊果酸为例对成分与靶点对接结果进行可视化展示，见图6。

图5 黄芩-连翘治疗重症肺炎的主要活性成分与主要靶点结合能热图

图6 beta-谷甾醇成分与靶点对接结果

讨 论

本次研究采用网络药理学和分子对接研究方法，利用数据挖掘技术找出黄芩-连翘活性化学成分60个，潜在靶点241个，其中与重症肺炎交集靶点160个，发挥作用的中药活性成分50种，GO富集分析共2702条，KEGG分析共244条，分子对接表明主要活性成分与重症相关靶点具有稳定的结合活性。

通过对黄芩-连翘治疗重症肺炎的药物-成分-靶点网络网络分析，活性较高的成分为：槲皮素、木犀草素、山奈酚等，相关研究表明槲皮素通过抑制寡聚物的形成，显著降低了肺炎球菌溶血素（Pneumolysin，PLY）诱导的溶血活性和细胞毒性，减少PLY介导的细胞损伤，提高感染致命剂量肺炎双球菌的小鼠的存活率，减轻肺组织的病理损伤，抑制支气管肺泡灌洗液中细胞因子（IL-1β和TNF-α）的释放[16]。此外，槲皮素通过促进细胞氧化应激，以及通过激活犬尿氨酸途径减少局部L-色氨酸的可用性来限制细菌生张[17]。木犀草素可以通过抑制脂多糖（LPS）诱导的BEAS-2B细胞中miR-132的表达从而减少细胞凋亡和炎症细胞因子的表达，从而减少LPS诱导的炎症性损伤[18]。山奈酚可有抑制炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和PGE2的表达，改善肺部水肿，同时还可抑制NFκB和MAP激酶的磷酸化，在体外和体内发挥抗炎作用[19]。

PPI网络显示，黄芩-连翘药对的活性成分主要通过作用于 AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF等靶点发挥治疗重症肺炎的作用。Akt1与细胞代谢、生存迁移和基因表达有关，当机体发生急性炎症时，Akt1可以通过调节血管通透性，导致水肿和白细胞外渗[20]。IL-6作为多功能炎性细胞因子，是炎性介质网络的关键成份，IL-6过度合成则会导致“细胞因子风暴”[21]。TP53 是重要的抑癌基因，在调节细胞生长、细胞凋亡和 DNA 修复中发挥重要作用[22]。VEGFA是一种强效的血管生成和血管通透性因子，其水平与炎症反应和血管内皮通透性呈正相关[23]。TNF-α能够通过促进caspase-3活化发挥肺泡上皮细胞凋亡促进作用，从而造成肺泡上皮细胞损伤[24]。

通过分析预测黄芩-连翘药治疗重症肺炎的通路发现，该药对主要是通过影响IL-17通路、TNF通路等发挥作用。相关研究表明，IL-17的过度表达可以使中性粒细胞大量汇聚及炎症因子分泌，激活炎症反应，造成肺泡内皮损伤及组织通透性增加[25]。此外，IL-17的血清含量与急性肺损伤患者的病情严重程度及疾病预后都呈正相关[26]。TNF-α是由巨噬细胞分泌的炎性因子[27]，与各类炎症反应及血管内皮通透性有关，临床上使用阻断TNF-α作用的药物治疗干燥综合征、系统性红斑狼疮和克罗恩病等炎症相关疾病，说明了TNF在炎症中的核心作用[28]。

本研究利用网络药理学和分子对接方法，初步对黄芩-连翘药对的活性化合物、潜在的治疗靶点及治疗重症肺炎的分子机制进行探讨，为下一步研究提供参考。