中药有效成分消除G-菌耐药性研究进展

左丽，旷年玲，邓聪聪，吕兴帮，张博，吴逸琳，张永英

（河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北 邯郸 056000）

抗生素作为广谱抗菌药物，对治疗动物疾病具有重要作用。但过度应用抗生素，使细菌耐药现象日趋严重[1]。革兰氏阴性菌（G-菌）因其独特的细胞壁结构导致耐药现象更为严重，主要表现在多重耐药、耐药机制复杂等方面，不仅对养殖业造成了巨大损失，也为人类食品安全带来了巨大隐患。因此，消除细菌耐药性恢复其对抗菌药物敏感性成为研究热点。目前多采用化学合成的抗菌增敏药物对抗细菌耐药性，但易产生毒副作用，如十二烷基硫酸钠（SDS）[2]。中药来源丰富、毒副作用小、不易产生耐药性、在消除细菌耐药方面具有多靶位效应等优点，近年来受到研究者的广泛关注[2]。但中药成分复杂，药效成分和含量受产地、收获季节、炮制方式等因素影响较大，在动物临床应用中受到很多限制。而中药有效成分避免了中草药的缺点，同时还具有多靶性和无耐药性等优点[3]，成为消除细菌耐药性方面的研究热点。文章对G-菌耐药性的研究现状以及耐药产生机制、中药有效成分消除G-菌耐药性的研究现状和中药有效成分协同消除G-菌耐药性研究进展进行综述，以期为中药有效成分逆转G-菌耐药性提供参考。

1 G-菌耐药现状和耐药产生机制

1.1 G-菌耐药现状

G-菌因具有特殊结构的细胞壁更易产生耐药性。与革兰氏阳性菌（G+菌）相比，G-菌细胞壁主要有3点不同：

（1）G-菌的肽聚糖层更薄。

（2）肽聚糖层外具有亲水性和疏水性双重特性的外膜双分子层，包含脂多糖（LPS）分子、磷脂和外膜蛋白（OMPs）[4]。上述动态外膜构成对抗抗生素的屏障，大部分抗菌药物必须穿过外膜才可具有抗菌作用，其中氯霉素和氨基糖苷类疏水抗生素可利用脂质通道进入胞内，但其他疏水抗生素和极性分子无法进入，可能与LPS作用有关。

（3）G-菌外膜和细胞壁之间存在周质间隙。β-内酰胺类抗生素利用孔蛋白(Porin)等通道蛋白进入细胞周质[5]，但具有胞质靶点的分子因内膜限制而无法进入细胞质[6]，从而无法达到治疗效果。因此产生的耐药性难以消除，G-菌疾病的治疗更加复杂[7]。

近年来多重耐药菌数量急剧增加，冯敏燕等[8]测定2008—2014年山东省不同地区鸡场分离的210株大肠杆菌对14种抗生素的耐药性，发现大肠杆菌对13种抗生素（多西环素除外）的耐药率有所增长，对其中10种抗生素的耐药率增长1倍甚至更高。Huber等[9]对2013—2019年加拿大肉鸡中沙门氏菌、弯曲杆菌和大肠杆菌的耐药性进行了调查，发现2014年加拿大实施家禽业减少抗生素使用战略后，耐药菌对抗生素的耐药性下降了6%～38%，表明当某一种高耐药性的抗生素（如头孢类抗生素）退出临床使用后，G-菌逐渐会对另一种抗生素（如氨基糖苷类抗生素）产生耐药性，形成恶性循环。崔莹等[10]对河南郑州生禽肉样品进行检测，发现检出的26株致泻大肠杆菌耐药率达96.15%，其中对四环素耐药率高达84.62%，对5种及以上抗生素耐药的菌株占68%。Lenart-Boron等[11]从某污水处理厂附近河流分离出50株大肠杆菌，发现该大肠杆菌对阿莫西林耐药菌株高达90%，氨苄西林耐药菌株占36%，头孢菌素耐药菌株占30%，对3种及以上抗生素耐药的大肠杆菌占40%。张立伟[12]对河北地区鸡源大肠杆菌耐药性进行检测，发现56株大肠杆菌中对β-内酰胺类抗生素耐药的菌株最多，对氨苄西林耐药的菌株占94.64%，多数菌株对5种及以上的抗生素具有耐药性。Datok等[13]发现，从尼日利亚某城市出售的300份烤牛肉样品中分离出的大肠杆菌对氨苄西林的耐药率高达100%，其次是阿莫西林/克拉维酸、环丙沙星、呋喃妥因、亚胺培南和头孢曲松，多重耐药大肠杆菌占97.5%。上述研究表明，G-菌对临床常用的多种抗生素表现较高的耐药性，且耐药谱不断变广。

1.2 G-菌耐药产生机制

细菌耐药机制包括内在耐药和获得耐药[9]。内在耐药是编码染色体DNA的稳定遗传特性，由该属全部成员共享。细菌可通过宿主染色体DNA突变或得到携带耐药基因的染色体获得耐药性[14]，其产生机制主要分为以下5类：

（1）产生使药物失活的酶。耐药菌能够产生通过水解或修饰作用破坏抗生素结构使其失去活性的酶，如β-内酰胺酶可打开青霉素和头孢菌素的内酰胺环，破坏药物结构使其完全失去抗菌活性；氨基糖苷类抗菌药物钝化酶（氨基糖苷酰基转移酶等）对氨基糖苷类分子中的必需基团进行化学修饰，使其与作用靶位核糖体的亲和力大幅降低，如氯霉素乙酰转移酶使氯霉素乙酰化，失去抗菌作用[15]。

（2）主动外排机制。存在于细胞膜内的蛋白质复合物可排出进入细胞质的抗生素和毒素，从而使细胞内有毒化合物浓度降低到亚毒性水平。这些蛋白质对不同结构抗生素的识别和外排存在不同的位点和机制[16]。

（3）药物作用靶点改变。细菌能够改变抗生素作用靶位的蛋白结构和数量，从而影响与药物的结合。如肺炎链球菌耐红霉素是由质粒介导的甲基化酶使23S rRNA中一个关键性的腺嘌呤残基甲基化，使抗菌药物进入胞内后无法与之结合发挥作用[17]。

（4）细胞膜通透性降低。细胞外膜上的孔蛋白是一种非特异性的、跨越细胞膜的水溶性扩散通道，抗菌药物必须进入细菌内部到达作用靶点后才能够发挥抗菌作用。细菌的细胞壁障碍或外膜通透性改变均可严重影响抗菌药物的抗菌作用，如细菌细胞膜微孔缺失，亚胺培南难以进入胞内，从而失去抗菌作用[15]。

（5）细菌自身代谢状态改变。细菌可通过改变自身状态逃避药物作用，休眠状态或营养缺陷的细菌耐多种抗生素[10]。生物被膜是细菌为适应生存环境，吸附于生物或非生物表面的细胞群落，能够阻止药物渗透到细菌细胞内，具有保护细菌逃逸抗菌药物的杀伤作用[7]。

2 中药有效成分消除G-菌耐药性研究现状

张石磊等[18]研究发现，亚抑菌浓度小檗碱与多重耐药大肠杆菌共培养3 d后，左氧氟沙星的最低抑菌浓度（MIC）由16 mg/L降至8 mg/L，表明小檗碱对大肠杆菌耐药性具有消除作用。Qu等[19]研究发现，槲皮素与耐多黏菌素菌株共培养后，多黏菌素的MIC由4～256 mg/L降至1～64 mg/L，表明槲皮素可显著提升耐药菌对多黏菌素的敏感性。郭岩[20]研究发现，和厚朴酚能够显著恢复MCR-1阳性的大肠杆菌、沙门菌以及肺炎克雷伯菌对多黏菌素的敏感性。由此可见，中药有效成分可通过多种耐药消除机制降低G-菌大肠杆菌对抗菌药物的耐药性。

2.1 酶抑制剂

G-菌能够产生抗生素的水解酶，使抗生素活性降低或失去活性，以β-内酰胺类酶最为普遍[21]，可水解β-内酰胺类抗生素的活性结构，使其失去抗菌活性。其中ESBLs和新德里金属β-内酰胺酶（NDM-1）可降低β-内酰胺类抗生素对大肠杆菌的抑制作用。第二类抗生素的水解酶是氨基糖苷类修饰酶（AMEs），包括N-乙酰转移酶（AAC）、O-核苷酸转移酶（ANT）和O-磷酸转移酶（APH）[22]，可通过共价修饰药物上的特定氨基或羟基灭活氨基糖苷类抗生素，使抗生素失去抑菌活性。第三类是四环素钝化酶，可通过降解四环素使其失去活性[20]。曹敏[23]研究发现，芦荟大黄素、槲皮素、香紫苏醇、木樨草素、苦参碱、大蒜素和五味子甲素7种中药单体对β-内酰胺酶具有一定的抑制作用，其中，芦荟大黄素对β-内酰胺酶活性抑制作用最强。茶提取物-黄素-3,3二氨基甲（TFDG）也能够有效抑制ESBLs活性，增强β-内酰胺类药物的药效[24]。贾芳等[25]研究发现，2.5～15.0 g/L的苦豆子碱既可对大肠杆菌产生抑制作用，还可降低ESBLs活性。因此，中药有效成分具有抑制酶活性的能力，可提高耐药菌株对抗菌药物敏感性。

2.2 外排泵抑制剂

G-菌依靠跨越双膜的3种蛋白复合体从细胞中泵出抗生素。3种蛋白复合体包括抗性结瘤细胞分裂（RND）家族的内膜蛋白（IMP）、外膜蛋白（OMP）及连接两个蛋白的胞膜融合蛋白（MFP）[26]。外排泵具有底物选择广泛的特点，以此形成对抗生素的非特异性耐药。外排泵抑制剂（EPIs）的研发对恢复多重耐药G-菌的敏感性具有重要意义。刘三侠[27]研究发现，经小檗碱处理的多重耐药大肠埃希菌外排泵AcrA-mRNA表达量显著降低，表明小檗碱能够抑制细菌主要外排系统AcrAB-Tolc。Choudhury等[28]研究发现，香豆素能够抑制铜绿假单胞菌MexAB-OprM外排泵MexB蛋白表达，抑制细菌耐药性。综上，中药有效成分能够显著抑制G-菌的外排泵作用以及相关基因的表达，从而消除细菌耐药性。

2.3 生物被膜抑制剂

生物被膜是指细菌被自身产生的多聚复合物基质包绕的异质性细菌群体，附着于无活性物体或活体物体表面[15]。一般情况下，生物被膜通过降低菌体代谢速率和对抗生素的通透性阻止或减少抗生素进入体内，进而产生抗生素耐药性[29]。景春娥等[30]研究发现，黄芩苷能够降低阪崎克罗诺杆菌的附着性，抑制生物被膜形成，且鞭毛合成基因、生物被膜形成相关基因、生物被膜群体感应因子和转录调节因子转录水平均有所下调。张凯等[31]研究发现，不同浓度的厚朴酚对同一耐药菌生物被膜形成均可产生抑制作用。黄盼等[32]研究发现，5 g/L的甘草酸可显著抑制耐药菌生物被膜形成，10 g/L的甘草酸处理的耐药菌几乎不形成生物被膜。综上，中药有效成分通过抑制耐药G-菌生物被膜形成可消除G-菌耐药性。

2.4 耐药质粒消除剂

细菌产生耐药性最主要的机制是获得耐药质粒[14]。耐药基因在细菌之间转移，可整合到细菌的染色体中，代代稳定遗传，也可在细菌质粒上保持在染色体外状态，由质粒介导的耐药性可伴随耐药质粒的消除而逆转。汪东海等[33]研究发现，与处理前相比，经0.1～1.0 g/L黄芩苷处理的鲍曼不动杆菌耐药菌株质粒消除率为6.3%～37.5%，且呈剂量依赖性。王新兴等[34]研究发现，MIC浓度的小檗碱可消除MCR-1阳性大肠杆菌耐药质粒，消除率为26.9%；经荧光定量PCR检测发现，经小檗碱作用后，由质粒编码的MCR-1基因也被消除。综上，中药有效成分通过消除耐药质粒达到消除G-菌耐药性的作用。

3 中药有效成分协同消除G-菌耐药性

G-菌耐药性产生由多重耐药机制介导，单一消除剂无法抑制全部耐药机制，多种消除剂联合应用才是消除细菌多重耐药机制的有效手段。徐倩倩等[35]研究发现，黄连-诃子、山楂-芦荟、芦荟-乌梅等7对中药联合应用时显示协同作用，FIC指数为0.28～0.50；黄连-山楂、芦荟-五味子等9对药物联合应用呈现相加作用，FIC指数为0.56～1.00；27对药物联用呈现拮抗作用，FIC指数均大于2。王芝超[36]发现，山楂可消除1～3条耐药大肠杆菌耐药质粒条带，黄连可抑制耐药菌β-内酰胺酶活性，降低大肠杆菌外排泵AcrAB-TolC转录水平，生物被膜由强附着性变为弱附着性，山楂黄连组方对鸡源大肠杆菌病治愈率达90%。

4 结论

目前对中草药复方消除细菌耐药研究较多，但中药成分复杂，药效受采摘季节、产地、炮制方式、制备浓度等诸多因素影响，导致临床治疗细菌性疾病尚无统一标准。而药效明确、浓度可控的中药有效成分可避开此弊端，更具临床应用价值。因此，研发多靶点消除细菌多重耐药性的中药有效成分消除剂是发展趋势。