β-羟丁酸对牛肺泡巨噬细胞促炎细胞因子释放的影响研究

夏 青，才冬杰，方 静，王之盛，邓俊良，易 军，左之才，*

(1.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130；2.四川农业大学 动物营养研究所，四川 成都 611130；3.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066)

放牧牦牛在草枯期会长期处于饥饿状态，进而导致机体血糖下降，血液BHBA浓度升高，机体抵抗力下降；极易因感染细菌、病毒等造成牦牛发生呼吸系统疾病，其发病率死亡率升高。而BAMs是牛肺部重要的免疫防御细胞之一，它参与病原吞噬、抗原递呈以及炎症反应等过程，能有效抵御外来病原菌的侵入。BHBA在机体处于能量负平衡时可作为ATP 的替代能源供给，但近年来研究报道，BHBA除了作为能源物质外，其浓度的升高与过渡期间奶牛发生的子宫内膜炎和乳腺炎有一定关系，可作为信号分子激活p38MAPK、NF-κB等炎症信号传导途径。研究发现，高浓度BHBA通过激活中性粒细胞NF-κB信号通路，导致细胞发生炎症反应。这些研究表明，BHBA也可能与BAMs发生炎症反应有关，但其潜在机制尚不清楚。因此，本次试验的目的就是利用BHBA诱导牛肺泡巨噬细胞后，探讨其能否促进IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎细胞因子的释放，为深入探究BHBA与肺部免疫功能之间的关系奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

β-羟丁酸(Sigma，美国)，低糖DMEM培养基(Solarbio，中国)，胎牛血清[生工生物工程(上海)股份有限公司，中国]，CCK-8试剂盒(碧云天，中国)，Premix酶、反转录酶试剂盒(TaKaRa，日本)，IL-1β、IL-6及TNF-α ELISA试剂盒(晶美生物工程有限公司，中国)，GPR109A、p38MAPK、NF-κB、PPARγ 实时荧光定量引物序列[生工生物工程(上海)股份有限公司，中国]。

1.2 方法

1.2.1 BAMs的分离与分组

按照实验室以前的方法，采集健康牦牛带有12 cm气管的完整肺部，PBS(无菌并含有青霉素200 U·mL，链霉素200 μg·mL)洗净肺表面，再将PBS经气管灌入肺部，适当轻揉肺部，收集灌洗液。灌洗液经200目纱布过滤，1 200×离心6 min，收集细胞沉淀。再用PBS洗涤细胞，1 200×离心6 min。加细胞培养液(含10 %胎牛血清)重悬细胞，经细胞计数，置于5% CO、37 ℃细胞孵育箱内贴壁培养6 h，用PBS洗去未贴壁细胞，胰酶消化并重悬细胞，台盼蓝染色，计算细胞存活率。将细胞浓度调整为1×10mL，分装于细胞板中，置于细胞孵育箱内培养3 h。加4 mmol·L终浓度BHBA进行诱导，分别在诱导后的0、3、6、12、24 h收集上清液和下层细胞(每组设置3个平行)，以及使用0、1、2、4 mmol·LBHBA分别诱导BAMs 12 h后收集上清液和下层细胞(每组设置3个平行)。

1.2.2 BHBA的配制

用无菌去离子水(ddHO)溶解BHBA，分别配制1、2、4、8、16、32 mmol·L6个浓度梯度，0.22 μm滤膜过滤除菌，于-20 ℃保存备用。

1.2.3 BHBA对牛肺泡巨噬细胞活力的影响

使用CCK-8法检测BAMs在不同浓度的BHBA处理不同时间后的细胞活力。将1×10mL的细胞悬液接种到96孔板中，置于5% CO、37 ℃细胞孵育箱内培养6 h。细胞完全贴壁后，分别加入浓度为0、1、2、4、8、16、32 mmol·L的 BHBA(每种处理浓度做6个平行)，再分别孵育12、24 h。最后，将10 μL CCK-8溶液添加到每个孔中，并将96孔板置于培养箱中继续培养3 h后，用酶标仪测量细胞在450 nm处的吸光度，再计算出细胞活力。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测BAMs109、38、-、mRNA表达水平

采用Trizol法提取培养BAMs总RNA，并测定总RNA浓度及纯度。按照试剂盒说明书进行反转录，cDNA保存于-20 ℃。以cDNA为模板，检测109、38、-、基因的mRNA表达量，引物序列见表1。cDNA进行10～10的10倍系列稀释，制作标准曲线。反应体系：上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，Premix6 μL，模板5 μL。反应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，40个循环，每个循环后检测荧光。

表1 各基因实时荧光定量引物序列

1.2.5 酶联免疫吸附测定BAMs上清1L-1β、IL-6、TNF-α水平

按照ELISA试剂盒说明书检测细胞上清中1L-1β、IL-6、TNF-α促炎细胞因子表达水平。每个实验独立重复3次。

1.2.6 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 CCK-8法检测细胞活力

用CCK-8法检测不同浓度BHBA对BAMs的细胞活力影响可见，在添加BHBA培养12 h后，1、2、4 mmol·L三组与对照组差异不显著，8 mmol·L组差异显著(<0.05)，16、32 mmol·L组差异极显著(<0.01)(图1-A)。添加BHBA培养24 h后的结果与12 h的结果相似，1、2、4 mmol·L三组与对照组差异不显著，8、16、32 mmol·L组差异极显著(<0.01)(图1-B)。结果表明，与空白对照相比，用1、2、4 mmol·L的BHBA刺激BAMs 12、24 h后，其细胞活力没有统计学差异，因此，选择该3个浓度做后续试验。

*，表示与对照组相比差异显著(P<0.05)；**，表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)。下同。

2.2 BHBA对BAMs GPR109A、p38MAPK、NF-κB、PPARγ mRNA表达量的影响

采用qRT-PCR检测BAMs中109、38、-、mRNA表达量。结果显示，4 mmol·L的BHBA处理BAMs 0、3、6、12、24 h后，109mRNA表达量在6 h时显著上调(<0.05)，且呈时间依赖效应上调；38mRNA表达量于12 h达到最高；-mRNA表达量在6、12、24 h极显著上调(<0.01)；mRNA表达量在3、6 h极显著上调(<0.01)，但随后12、24 h呈下调趋势(图2)。

图2 BHBA诱导时间对牛肺泡巨噬细胞GPR109A、p38MAPK、NF-κB、PPARγ基因表达的影响

不同浓度的BHBA作用于BAMs 12 h后，与对照组相比，109、38、-mRNA表达量均随浓度的增加而上调，在4 mmol·L时均达到极显著(<0.01)；mRNA表达量则在2 mmol·L组呈显著上调(<0.05)，1、4 mmol·L组mRNA表达量与对照组相比，差异无统计学意义(图3)。

图3 不同浓度BHBA诱导牛肺泡巨噬细胞12 h对GPR109A、p38MAPK、NF-κB、PPARγ基因表达的影响

2.3 BHBA对BAMs 释放IL-1β，IL-6，TNF-α促炎细胞因子的影响

采用ELISA 法检测细胞培养液上清中IL-1β、IL-6、TNF-α表达量。结果显示，4 mmol·L的BHBA处理BAMs 0、3、6、12、24 h后，与阴性对照组相比，细胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α促炎细胞因子表达量呈现上升趋势，且均在6 h极显著上调(<0.01)(图4-A、B、C)。

不同浓度的BHBA作用于BAMs 12 h后，与对照组相比，IL-1β、IL-6、TNF-α促炎细胞因子表达量随BHBA浓度的增加而增加，且与对照组相比，1、2、4 mmol·L组的IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平均极显著上调(<0.01)(图4-D、E、F)。

图4 BHBA诱导时间和浓度对牛肺泡巨噬细胞培养上清中IL-1β、IL-6、TNF-α表达影响

3 讨论

BHBA是脂肪酸在肝线粒体基质中氧化产生的一种代谢中间产物，长期饥饿、糖尿病、高强度运动等情况会升高机体BHBA水平。但当血液循环中BHBA浓度的过度升高往往会通过激活氧化应激等途径触发促炎反应，导致细胞炎性损伤从而导致糖尿病酮症酸中毒等各种病理并发症的发生。还有研究报道，BHBA能增加牛子宫内膜细胞、犊牛肝细胞、奶牛中性粒细胞中IL-1β、IL-6及TNF-α等促炎细胞因子的释放，参与其炎性损伤过程。本次试验结果与前人研究结果相似，即BHBA也能促进BAMs促炎细胞因子的释放，且呈时间-剂量依赖效应增加。此外，本试验还发现1、2、4 mmol·LBHBA不影响BAMs存活率，但随着BHBA浓度的增加细胞存活率随之降低。

G蛋白偶联受体109A(GPR109A)，能在巨噬细胞、视网膜色素细胞等多种细胞中表达，BHBA是其内源性配体，能通过激活该受体进而抑制脂肪分解，以及释放游离脂肪酸和促炎或抗炎细胞因子来作出响应。脂多糖、TNF-α等多种炎性刺激物都能激活巨噬细胞发生免疫反应使GPR109A表达上调。NF-κB通路在免疫和炎症反应中起着至关重要的作用。研究表明，NF-κB与BHBA密切相关，是BHBA发挥炎症效应的关键分子。Shi等发现，BHBA会增加牛肝细胞中IκBa磷酸化水平，TNF-α、IL-6和IL-1β等浓度也显著增加。在本次试验中，4 mmol·LBHBA作用于BAMs，109、-mRNA表达量上调，且此过程中IL-1β、IL-6、TNF-α促炎细胞因子的释放量也呈时间依赖效应增加。表明BHBA促进BAMs释放IL-1β、IL-6、TNF-α，可能与GPR109A/NF-κB信号通路有关。

此外，p38MAPK被认为是NF-κB的上游调控因子，参与调节炎症反应。在本次试验中，38mRNA表达量随浓度和时间的增加而增加。PPARγ是属于配体激活的核受体家族的转录因子，除了具有调节糖脂代谢的作用以外，其抑炎机制也被广泛研究。在本次试验中，mRNA表达量在3、6 h极显著上调(<0.01)，但随着时间的延长，mRNA表达量在12、24 h下调，而-mRNA表达量、IL-1β、IL-6和TNF-α在6 h均极显著上调(<0.01)，这提示BHBA激活NF-κB信号通路促进促炎细胞因子的释放可能与mRNA表达量降低有关，进而降低PPARγ的抑炎作用，但其具体机制尚不明确有待深入探讨。明确BHBA诱导BAMs炎症反应的具体分子机制，有利于为牛肺部炎症疾病的预防和治疗提供新思路。