整合网络药理学和分子对接技术探讨“三药三方”核心药组防治COVID-19的分子机制研究

郭鹏飞 张永斌 许律捷 张宝月 赵君 刘艾林 杜冠华

摘要 目的：基于網络药理学方法探讨“三药三方”核心药组用于治疗新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）的中药特性及其作用机制。方法：借助《中华人民共和国药典》对治疗新型冠状病毒肺炎的“三药三方”核心药组进行中药四气五味归经毒性的分析。基于TCMATCOV平台进行药效分析，挖掘用药规律。利用生物信息学分析工具BATMAN-TCM数据库预测核心药组作用靶点。利用GeneCards、PubChem、DisGeNET和UniProt数据库和文献挖掘方法，获取COVID-19靶点。在此基础上，利用网络构建软件Cytoscape进行化学成分-中药-四气五味归经毒性网络的构建，并通过韦恩图和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建，筛选核心药组的候选靶标。然后，通过DAVID平台、Metascape和FunRich数据库对靶点进行富集分析。最后，应用CB-Dock分子对接软件对候选成分与关键靶点进行分子对接计算和验证。结果：“三药三方”共包含中药48味，药物四气多属温、平、寒，五味多属辛、甘、平，主要归属肺、胃、脾经，最后得到“三药三方”的核心药组为麻黄、广藿香、苦杏仁、甘草和石膏。核心药组共预测得到100个化学成分和449个靶点。通过韦恩图和PPI网络分析筛选得到77个候选靶标作用于COVID-19。富集分析得到361个GO生物学过程条目和120条KEGG通路。通过对信号通路的归类，发现核心药组参与人体的感染性疾病系统、免疫系统、神经系统、内分泌系统等多条信号通路起到治疗COVID-19的作用。结论：本研究基于网络药理学方法和技术，探讨了“三药三方”治疗新冠肺炎的药性归经、潜在活性成分、作用靶标及其生物学过程和通路，为三药三方的临床应用提供重要信息依据，并为新药的进一步研究提供重要信息。

关键词 新型冠状病毒肺炎;“三药三方”;核心药组;网络药理学;分子对接

Mechanism of Core Combination in “Three Medicines and Three Prescriptions” for COVID-19 Treatment by Integrated Network Pharmacology and Molecular Docking

GUO Pengfei1，ZHANG Yongbin2，XU Lyujie1，ZHANG Baoyue1，ZHAO Jun1，LIU Ailin1，DU Guanhua1

（1 Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100050，China; 2 Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

Abstract Objective：To explore the characteristics and molecular mechanism of core combination in “three medicines and three prescriptions” against Coronavirus Disease 2019（COVID-19） based on network pharmacology.Methods：The core combination in “three medicines and three prescriptions” was analyzed for Chinese medicine properties（qi，flavor，and meridian tropism） and toxicity with the aid of the Chinese Pharmacopoeia（2015）.The drug efficacies were analyzed and the medication regularity was summarized based on the TCMATCOV platform.The targets of the core combination were predicted by the BATMAN-TCM and COVID-19 targets were obtained from data mining and databases，such as GeneCards，PubChem，DisGeNET，and UniProt.Cytoscape was used to construct a chemical component-core combination-Chinese medicine property and toxicity network.Subsequently，the Venn diagram and protein-protein interaction（PPI） network were employed to screen the candidate targets of the core combination.Then the targets were enriched and analyzed by DAVID，Metascape，and FunRich.Finally，CB-Dock was used for molecular docking calculation and verification of candidate components and key targets.Results：The “three medicines and three prescriptions” contain 48 Chinese medicinal drugs，and most of them are warm，plain，and cold in nature，pungent，sweet，and plain in flavor，and act on lung，stomach，and spleen meridians.Based on the frequency statistics，the core combination in “three medicines and three prescriptions” contains Ephedrae Herba，Pogostemonis Herba，Armeniacae Semen Amarum，Glycyrrhizae Radix et Rhizoma，and Gypsum Fibrosum.As revealed by results，100 chemical components and 449 potential targets of the core combination were obtained，and 77 candidate targets were screened out to act on COVID-19 according to the Venn diagram and PPI network.The enrichment analysis yielded 361 entries of GO biological processes and 120 KEGG pathways.In light of the classification of signaling pathways，the core combination may participate in multiple signaling pathways in the infectious disease system，immune system，nervous system，and endocrine system of the human body to treat COVID-19.Conclusion：The present study explored the Chinese medicine properties（qi，flavor，and meridian tropism），potential active components，and targets，as well as biological processes and pathways of “three medicines and three prescriptions” for the prevention and treatment of COVID-19 based on the network pharmacology，which is expected to provide references for clinical application of “three medicines and three prescriptions” and further development of new drugs.

Keywords COVID-19; “Three medicines and three prescriptions”; Core combination; Network pharmacology; Molecular docking

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.02.003

新型冠状病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）疫情自2019年12月以來全球已有200多个国家和地区受到影响。中医药用于治疗新冠肺炎的战役已经取得了重要进展，并且取得了较好的临床效果。夏文广等[1]回顾性分析52例COVID-19中西医结合治疗疗效，发现中医药临床治愈率为94.1%及普通型转重型发生率为59%，均明显优于西医组。国家卫健委也已将中医药治疗COVID-19纳入《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第三版）》，并一直延续至“第六版”。

国家中医药管理局指出，“三药三方”中金花清感颗粒（JHQGKL）、连花清瘟胶囊/颗粒（LHQWKL/JN）、血必净注射液（XBJZSY）和清肺排毒汤（QFPDF）、化湿败毒方（HSBDF）和宣肺败毒方（XFPDF），在此次COVID-19疫情的防治工作中具有非常好的临床优势。其中，JHQGKL是《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第四版至第七版）》推荐中成药;LHQWKL/JN是《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第五、六七版）》推荐中成药;五版和七版《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》将XBJZSY分别纳入治疗重型和危重型COVID-19方案中。七版《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》将QFPDF、HSBDF、XFPDF作为治疗新冠肺炎各型的患者中成药[2-6]。

现代药理学对药物的研究聚焦于单一成分作用于单一靶标的机制，而中药网络药理学的研究旨在从系统层次和分子水平揭示中药方剂“药物多成分，多网络靶标”的奥秘，开启了中药研发的新方法新模式，是目前中药药效物质基础研究的重要手段之一。分子对接技术是基于受体与药物分子之间相互作用，通过计算研究配体和受体分子在结合过程中的构象变化，从而达到辅助药物筛选的目的，现已广泛用于中药及复方活性成分与疾病靶标的研究[7]。本研究对“三药三方”的用药频次、药组规律、核心药组等进行系统分析，通过网络药理学方法和分子对接技术筛选出“三药三方”核心药组的候选化学成分和潜在靶点，构建“化学成分-中药-中药四气五味归经毒性”网络、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络、靶点功能富集网络图等多层次生物信息学网络，探讨“三药三方”核心药组中抗COVID-19的潜在物质基础与作用机制，旨在为临床精准遣方用药、提高中医救治水平提供理论依据。见图1。

1 资料与方法

1.1 “三药三方”中核心药组中药频次和药效的分析 本研究通过《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第四版至第七版）》检索血必净注射液（XBJZSY）、连花清瘟颗粒/胶囊（LHQWKL）、金花清感颗粒（JHQGKL）、清肺排毒方（QFPDF）、化湿败毒方（HSBDF）、宣肺排毒方（XFPDF）的方药组成。核心药组的药效分析通过中药抗新型冠状病毒肺炎药效预测分析平台（TCMATCOV：http：//tcmatcov.bbtcml.com/）进行预测分析[8]，平台主要通过比较药物干预前后对于疾病网络拓扑特征的变化，最终以扰动分数来评价核心药组对COVID-19的干预，从而实现对中药药效作用的快速预测分析（不涉及矿物药）。

1.2 “三药三方”中核心药组化学成分和靶标的收集 本研究通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）检索核心药组中包含的药物成分并进行口服生物利用度（OB）、药物分子的类药性（DL）和药物成分半衰期（HL）的筛选。结合《中华人民共和国药典（2015版）》查找核心药组的四气五味归经和毒性的信息。根据核心药组中药物的拼音从BATMAN-TCM数据库进行药物靶标的预测并通过UniProt（https：//www.uniprot.org/）数据库进行基因名的标准化。

1.3 COVID-19靶点的收集及潜在靶点预测 使用PubChem（COVID-19 Data Available）、DisGeNET和GeneCards数据库预测COVID-19的部分靶标。同时收集近期有报道COVID-19靶标的药理学文献确定COVID-19的靶标集[9-10]。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建   将筛选出来的药物靶点和COVID-19潜在的靶标导入STRING（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins）网络平台，设置置信度（High_confidence）≥0.9作为条件进行筛选，最终获得候选靶标的互作关系。之后，将蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）数据导入Cytoscape软件中进行拓扑分析，并使用Cytoscape的MCODE功能对PPI网络进行模块划分和分析。

1.5 候选靶点的富集分析 将候选靶点导入DAVID[11]、Metascape[12]和FunRich[13]数据库进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析。分析结果在Omishare Tools（http：//www.omicshare.com/tools/index.php/）和Circos Tableviewer（http：//mkweb.bcgsc.ca/tableviewer/visualize/）将其可视化。

1.6 候选成分-靶点分子对接 以筛选的候选成分及临床推荐用药（瑞德西韦、利巴韦林、洛匹那韦）和抗COVID-19药物潜在作用靶点ACE2、RdRp、3CLpro进行分子对接。从RCSB PDB（https：//www.rcsb.org/）蛋白质结构数据库下载靶点的3D结构的pdb格式文件，在ChemicalBook（https：//www.chemicalbook.com/）数据库中获得候选化学成分的SDF格式文件，通过CB-Dock（http：//cao.labshare.cn/cb-dock/）网站进行分子对接，CB-Dock执行AutoDock Vina（1.1.2版本）。

2 结果

2.1 核心药组的来源、性能分析和药效预测 按照国家卫生健康委员会颁布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（第七版）》《方剂学》（七版中医教材）归纳“三药三方”的由来、功效及核心药组。“三药”中JHQGKL集经典名方麻杏石甘汤、银翘散、白虎汤为一体，具有疏散风热、清热解毒之功效;LHQWKL/JN集经典名方麻杏石甘汤、银翘散为一体，具有清瘟解毒，宣肺泄热之功效;XBJZSY在血府逐瘀汤基础上研制成功，用于温热类疾病的瘀毒互结证。“三方”中QFPDF集经典名方麻杏石甘汤、麻杏薏甘汤、葶苈大枣泻肺汤、千金苇茎汤为一体;HSBDF集经典名方麻杏石甘汤、葶苈大枣泻肺汤为一体;XFPDF集经典名方麻杏石甘汤、麻杏薏甘汤、葶苈大枣泻肺汤、千金苇茎汤为一体。“三方”可结合患者实际情况使用，适合轻症、普通型和重症COVID-19患者的治疗。“三药三方”中共计方药48个，其中使用频次大于3的有5味中药：麻黄、甘草、苦杏仁、石膏和广藿香，使用频次小于等于3的方药43个。本研究把频次大于3的5味中药作为“三药三方”的核心药组。核心药组的5味中药四气主要属辛、甘、苦和微苦，五味主要属微温、温、平、大寒，其中苦杏仁有小毒。核心药组主要归脾、胃、肺经。见图2。

TCMATCOV数据库预测结果表明，麻黄、甘草和广藿香的扰动总评分均大于阴性对照半夏天麻白术汤，说明麻黄、甘草和广藿香对COVID-19疾病网络有很强的干预作用，因此认为对COVID-19有一定的藥效。而苦杏仁的扰动总评分小于阴性对照半夏天麻白术汤，说明苦杏仁可能对于COVID-19的干预作用小于麻黄、甘草和广藿香。见表1。

2.2 核心药组-化学成分网络构建 通过筛选共收集到化学成分100个，包括常见的黄酮类如槲皮素（Quercetin）、甘草素（Licoisoflavone）;甾醇类如谷甾醇（Sitosterol）、豆甾醇（Stigmasterol）;有机酸如没食子酸（Gadelaidic Acid）。见图3。

2.3 PPI网络的构建和候选靶标的筛选 韦恩结果表明，核心药组的预测靶标和COVID-19靶标共有96个靶标重叠。见图4A。运用STRING工具进行重叠靶标的PPI网络构建，选择置信度（Highest_confidence）≥0.9作为筛选的标准，最后筛选出77个候选靶标。分值排名前6的靶标对分别是AKT1-GSK3B、JUN-FOS、MAPK8-JUN、CHUK-NFKBIA、CTNNB1-GSK3B。同时使用Cytoscape的MCODE功能对PPI网络进行模块分析，联系最为紧密的前5个模块见图4B。其中，MCODE_1主要涉及的功能是白细胞介素信号转导、细胞因子介导的信号通路和白细胞介素-4、白细胞介素-13信号，主要调控免疫与炎症反应。MCODE_2主要涉及的功能是癌症的通路、细胞对氧化应激的反应以及对无机物的反应。周敏等[14]回顾性分析了60例COVID-19患者的临床特征、血清多项炎症细胞因子水平。依据患者是否发生严重事件（无创或有创机械性通气，转入ICU或死亡），分为严重事件组（25例）和非严重事件组（35例），并通过单因素及多因素logistic回归分析影响预后的危险因素。结果表明，严重事件患者血清炎症相关标志物hs-CRP、降钙素原、铁蛋白，以及炎症细胞因子IL-2R、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α水平均较非严重事件患者明显升高。本研究预测的候选靶标的炎症介质有IL10、IL13、IL1A、IL1B、IL2、IL4、IL6和TNF。说明COVID-19和免疫与炎症介质紧密相关。

2.4 候选靶标的KEGG、GO富集分析 为了更进一步探讨核心药组通过调控候选靶标来预防和治疗COVID-19的具体机制，通过DAVID和Metascape数据库对77个候选靶点进行KEGG和GO富集分析。

KEGG通路富集分析最后得到120条信号通路，涉及传染病的通路有20条，分为传染病（细菌）、传染病（寄生虫）、传染病（病毒）3类。其中富集显著性最大的前5条传染病相关的通路有hsa05133、hsa05142、hsa05140、hsa05164和hsa05145，候选靶标在传染病系统方面发挥着重要的作用。见表2，图5A。将富集到的120条通路手动输入到KEGG数据库进行通路的系统分类，最后发现，候选靶标富集的通路还包括免疫系统、神经系统、消化系统和信号转导等。GO分析主要富集到361个生物学过程条目，主要囊括对脂多糖的反应、对无机物的反应、凋亡信号通路、细胞因子的正调控和DNA结合转录的调控等。见图5B。

2.5 候选靶标分子功能、细胞组分、表达位点和临床表型的富集分析 FunRich富集分析结果显示，细胞组分中所涉及细胞外空间细胞外区域、胞质溶胶、细胞质、Axin-APC-β-连环蛋白-GSK3B复合物和血小板α颗粒腔等。分子功能集中于细胞因子活性、超氧化物歧化酶活性、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、配体依赖性核受体活性和转氨酶活性等功能。表达位点主要涉及人体的子宫内膜、前脂肪细胞、甲状腺、肾和肺等器官。临床表型主要集中于胰岛素抵抗、免疫学、体力活动加剧、遗传异质性和头痛等症状。见图6。

2.6 分子对接结果分析 本研究选择类药性前4的化学成分与抗COVID-19药物潜在作用靶点ACE2（PDB ID：1R42）、RdRp（PDB ID：6NUR）、3CLpro（PDB ID：6LU7）分别进行分子对接验证。同时选择ACE2的抑制剂瑞德西韦、RdRp抑制剂利巴韦林，3CLpro抑制剂洛匹那韦与对应靶点对接作为阳性对照。利巴韦林和洛匹那韦已被《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第七版）》收录，并广泛应用于临床治疗[15]，研究表明瑞德西韦可在低浓度下能有效控制Vero E6细胞的SARS-CoV-2感染情况[16]。对接结果表明候选化学成分与靶点的对接打分数值均小于-5 kcal/mol。其中化学成分kanzonol F和靶标ACE2对接分数为最好为-10.1 kcal/mol，而且，所选择的候选化学成分与靶标的对接分数均优于与阳性药的对接结果。见表3，图7。最后结果表明核心药组的化学成分和所选择对接的靶标很可能为“三药三方”治疗COVID-19的关键成分和靶点。

3 讨论

在新冠肺炎疫情突然暴发时，临床上缺乏有效防控的药物，临时筛选开发新药周期长，难以及时应用于临床救治。中医药多靶点干预的独特优势成为救治患者不可或缺的系统方案。“大疫出良方”是中华民族几千年来同疫病做斗争的实践经验的生动总结，其中“三药三方”是中医药传承和创新的精华的体现。Li等[17]证明连花清瘟胶囊在mRNA水平上显著抑制SARS-CoV-2在Vero E6细胞中的复制，并显著降低促炎细胞因子TNF-α、IL-6、CCL-2/MCP-1和CXCL-10/IP-10的产生而起到抵抗病毒的作用。Liu等[18]发现血必净通过调节肺部炎症介质p-p38 MAPK、NF-κB65、HIF-1α、p-IκB-α和TGF-β1的表达有效减轻大鼠的急性肺损伤。段璨等[19]将湖北省中西医结合医院123例新冠肺炎患者随机分为观察组82例（给予金花清感颗粒每次6 g，每日3次，联合西医常规治疗）和对照组41例（仅给予西医常规治疗）并观察患者的临床疗效。结果显示，金花清感颗粒联合西医常规治疗能有效改善轻型新冠肺炎发热、咳嗽、乏力、咳痰等症状。2020年3月，化湿败毒方分别选择在金银潭医院、东西湖方舱医院、将军街社区卫生院开展临床疗效观察，结果显示相比纯西医治疗，本方在核酸转阴和症状的改善方面有显著差异[20]。临床实践证明，清肺排毒汤可以明显改善COVID-19重症患者的胸闷、气促、干咳和呼吸衰竭等癥状[21]。

在中医药治疗新冠肺炎作用研究中，网络药理学方法与分子对接技术已用于发现“三药三方”的潜在靶点与分子机制[22-27]，为临床研究提供了宝贵的参考信息。本研究采用网络药理学方法系统分析了“三药三方”中核心药组治疗COVID-19的潜在机制。

3.1 核心药组候选靶标 本研究通过PPI网络分析得到候选靶标涉及多种细胞因子，如IL10、IL13、IL1A、IL1B、IL2、IL4和IL6。研究表明，严重COVID-19中独特的免疫失调特征为IL-6介导的单核细胞细胞HLA-DR低表达和淋巴细胞减少，这一现象与持续的细胞因子产生和免疫炎症有关[28]。靶向ERK/MAPK（MAPK3）通路在病毒感染之前还是之后都在体外显著抑制了MERS-CoV复制，数据表明ERK/MAPK信号反应在MERS-CoV感染中起着重要作用[29]。通路富集分析表明，候选靶标JUN、CHUK、FOS、TNF、EGFR、IL1A、MAPK8、IL1B、CASP3、AKT1、MAPK1、RAF和MAPK3参与ERK/MAPK信号通路。

3.2 核心药组候选化学成分 Zhu等[30]利用人工智能药效预测系统发现甘草的主要成分之一甘草苷能抑制SARS-CoV-2在Vero细胞中的复制，EC50为2.39 μmol/L，揭示了甘草苷潜在的抗病毒机制，并在小鼠水平评价了甘草苷的安全性，实验结果表明甘草苷可明显抑制SARS-CoV-2在Vero细胞中的复制，其体外抗病毒效果与氯喹相近。本研究通过分子对接预测核心药组部分候选成分与对应靶点对接的分数均优于阳性药，说明其潜在的抗COVID-19的作用，但需后续进一步的药理学实验验证。

3.3 核心药组候选靶标通路富集分析

本研究表明，候选靶标富集的通路除了感染信号通路外，还涉及人体神经系统、免疫系统、消化系统和排泄系统等信号通路等。

3.3.1 神经系统 Jun等[31]研究发现病毒可以通过血源性途径、周围神经途径、嗅觉神经元途径对中枢神经系统的入侵而引起的神经系统变化。Mao等[32]对214例确诊为冠状病毒SARS-CoV-2感染并诊断出为严重急性呼吸道综合征SARS的住院患者的神经系统表现进行了研究，研究发现，严重的COVID-19患者通常具有神经系统症状，具体表现为急性脑血管疾病、意识障碍和骨骼肌症状。因此，对于COVID-19患者，除了呼吸系统症状外，医生还应密切注意神经系统表现。

3.3.2 免疫系统 Grifoni等[33]发现B细胞和T细胞表位在SARS-CoV-2和SARS-CoV之间具有高度保守性，靶向作用这些区域的疫苗或许能帮助机体产生特殊的免疫力，不仅能提供交叉感染的保护作用，还能有效抵御病毒未来的进化。Wen等[34]通过单细胞RNA测序技术全面表征COVID-19恢复期外周血单个核细胞的转录变化，结果发现在COVID-19的早期恢复期（ERS）患者中，CD4+T和CD8+T细胞显著减少，而CD14++？？和IL1β单核细胞增加。Bonam等[35]建议在严重的COVID-19病例中将免疫疗法作为辅助疗法，不仅可以减少炎症、炎症相关的肺损伤或病毒载量，而且还可以防止重症监护病房的住院和对机械通气的依赖。

3.3.3 消化系统、排泄系统 Wang等[36]收治了156例诊断为COVID-19的患者，通过电子显微镜、免疫组织化学、TUNEL分析和病理学研究患者肝功能损害的模式，发现肝脏感染SARS-CoV-2是COVID-19患者肝功能损害的重要原因。Zheng等[37]收集了3 000多个感染SARS-CoV-2患者样本的病毒载量，并分析了病毒载量的时间变化以及不同样本类型和疾病严重程度中病毒载量之间的相关性，结果表明，粪便样本中SARS-CoV-2的持续时间明显比呼吸道和血清样本长，并且在重症患者中，病毒在呼吸组织中以更长的时间和更大的负荷持续存在，达到峰值的时间更晚。Xiao等[38]成功从COVID-19患者的粪便和尿液标本中分离到多株SARS-CoV-2，并对分离出的病毒进行了全基因组测序以及病毒学鉴定。上述研究证实了COVID-19患者的粪便和尿液的确存在感染性活病毒，揭示了SARS-CoV-2的传播新途径。Diao等[39]对武汉市某医院收治的85例经实验室确认的COVID-19的患者的估算肾小球滤过率以及其他临床参数进行了回顾性分析，最后发现SARS-CoV-2可诱导COVID-19患者发生急性肾衰竭，病毒直接感染人肾小管以引起急性肾小管损伤。

综上所述，本研究应用网络药理学方法开展“三药三方”核心药组中化学成分靶标的预测和分析，最后通过生物信息学的手段和分子对接技术来探讨核心药组候选靶标和成分治疗COVID-19的物质基础和作用机制，其中部分机制的预测已经有药理学文献验证的证据，为进一步开展的实验研究提供了参考和线索。但是，鉴于中药化学成分不是简单的加和、中药成分含量和浓度会影响药效、中药成分与靶点的作用类型多样化等复杂特点，后续仍需要对“三药三方”药效成分群和候选靶标开展进一步的体内外验证与临床转化研究，以期开发出更适用于临床治疗COVID-19的有效天然化学成分。

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（2020-10-13收稿 本文編辑：魏庆双）