当归补血汤促进糖尿病足溃疡体外创口愈合机制的实验研究

黄 强，常金霞，郑 硕，牛少辉，曹 乾，方毅娜，曹建春，张东萍

近年来，糖尿病患者日益增多，而糖尿病并发症也成为目前医学攻克的重点。糖尿病足溃疡(diabetic foot ulcers, DFU)是糖尿病的常见严重慢性并发症之一，严重者甚至可致残和死亡[1-3]。越来越多的研究发现，在难愈合的糖尿病溃疡部位存在血管生成受损、内皮细胞及新生血管数量减少等现象[4]。因此，促进血管生成过程有利于DFU的治疗[5]。血管生成是一个动态的调控过程，血管内皮生长因子(VEGF)和一氧化氮(NO)是重要的调控分子[6-7]。我们的前期研究发现，当归补血汤可降低DFU大鼠模型炎症反应，促进新生血管生成，从而加快创口愈合[8]。为进一步探究当归补血汤促进血管生成的分子机制，本研究采用在高糖环境下培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作为研究对象，探究其对血管生成相关信号分子诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和VEGF调控的影响，旨在为DFU的临床治疗提供新的策略。

1 材料与方法

1.1材料 雄性Wistar大鼠30只，体质量180～190 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，适应性饲养1周，大鼠可自由进食和饮水。HUVECs购自上海素冉生物科技有限公司。当归和黄芪来自北京中医药大学东方医院；NO测定试剂盒(碧云天生物)，兔抗人VEGF抗体、兔抗人iNOS抗体均购自Abcam公司。

1.2实验方法

1.2.1当归补血汤含药血清制备：黄芪30 g、当归6 g，研磨至细末后加1000 ml水熬制成汤剂备用。大鼠按随机数字表法分为实验组(生药含量4 g/kg当归补血汤灌胃)20只和空白对照组(生理盐水)10只，灌胃体积2 ml/只，1/d，持续1周。最后一次灌胃1 h后，给予戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，于腹主动脉取血。室温静置2 h后，3500 r/min离心20 min取血清，置于56 ℃水中，水浴30 min。通过在HUVECs完全培养基中添加上述不同体积的血清制备0、15%、30%、60%当归补血汤含药血清培养基。

1.2.2细胞培养：为模拟糖尿病患者血糖情况，使用高糖DMEM培养基+10%胎牛血清培养HUVECs，培养环境设置为37 ℃，5% CO2。

1.2.3细胞增殖检测：MTT法测定HUVECs活力。HUVECs以2×104个/孔铺于96孔板中。正常培养基中培养，待生长至约80%融合，经PBS清洗，分别添加0、15%、30%、60%(V/V)当归补血汤含药血清培养24 h。待处理结束，吸出上层培养基每孔加入20 μl MTT染料，于37 ℃下孵育4 h，弃上清，加入150 μl DMSO，摇床震荡15 min，检测490 nm处吸光度。以最大细胞吸光度为100%，计算各孔相对增殖水平。

1.2.4体外创口愈合模型：用划痕法评价HUVECs的迁移和创口闭合。2×105个/孔将细胞铺于12孔板中，培养过夜后，使用无菌枪头在细胞上划痕，PBS洗涤去除细胞碎片，更换为0、15%、30%、60%当归补血汤含药血清的培养基。孵育48 h后经ImageJ测量迁移比例。迁移比例=(1-现有宽度/起始宽度)×100%。以最大迁移比例作为100%，比较各组间差异。

1.2.5NO水平测定：HUVECs于2×105个/孔平铺于6孔板中；细胞贴壁后更改为含0、15%、30%、60%当归补血汤含药血清培养基，处理48 h后，洗涤细胞，随后根据NO检测试剂盒说明书操作，检测细胞内NO含量。

1.2.6iNOS和VEGF蛋白含量检测：蛋白免疫印迹试验检测iNOS和VEGF蛋白表达水平。SDS-PAGE电泳提取和分离总蛋白，将蛋白质转移到PVDF膜上，5% BSA封闭1 h，然后，将膜在4 ℃与一抗孵育过夜。兔抗人iNOS和VEGF的孵育浓度为1∶2500。孵育结束后用TBST洗涤膜，用HRP结合二抗(1∶1000)孵育1 h，TBST清洗后，经化学发光检测系统检测。利用ImageJ软件行定量统计。

2 结果

2.1不同浓度当归补血汤对HUVECs增殖的影响 30%和60%当归补血汤含药血清组HUVECs相对活力高于空白对照组和15%当归补血汤含药血清组，60%当归补血汤含药血清组高于30%当归补血汤含药血清组(P<0.05,P<0.01)。见图1。

图1 不同浓度当归补血汤含药血清处理HUVECs增殖情况

2.2不同浓度当归补血汤含药血清对HUVECs迁移的影响 30%和60%当归补血汤含药血清组HUVECs迁移比例高于空白对照组和15%当归补血汤含药血清组，且60%当归补血汤含药血清组高于30%当归补血汤含药血清组(P<0.05,P<0.01)。见图2。

图2 不同浓度当归补血汤含药血清处理HUVECs迁移比例比较

2.3不同浓度当归补血汤含药血清对NO的影响 30%和60%当归补血汤含药血清组HUVECs NO相对含量高于空白对照组和15%当归补血汤含药血清组，60%当归补血汤含药血清组高于30%当归补血汤含药血清组(P<0.05,P<0.01)。见图3。

图3 不同浓度当归补血汤含药血清处理HUVECs NO相对含量比较

2.4不同浓度当归补血汤含药血清对HUVECs iNOS和VEGF表达的影响 与空白对照组比较，15%当归补血汤含药血清组HUVECs iNOS含量升高(P<0.05)。与空白对照组和15%当归补血汤含药血清组比较，30%和60%当归补血汤含药血清组HUVECs VEGF和iNOS含量显著升高(P<0.01)。与30%当归补血汤含药血清组比较，60%当归补血汤含药血清组HUVECs VEGF和iNOS含量升高(P<0.05)。见图4、5。

图4 不同浓度当归补血汤含药血清处理HUVECs中VEGF蛋白相对表达水平

图5 不同浓度当归补血汤含药血清处理HUVECs iNOS相对表达水平

3 讨论

DFU为常见严重的糖尿病并发症之一[9]。研究表明，血管再生和顺畅的血液流动性是组织修复必要环节，但是通常DFU血管生成受到抑制，血液流动性较差[10]。在本研究中，我们验证了当归补血汤可通过促进NO和VEGF的合成，促进HUVECs的增殖，加快DFU体外模型创口的愈合。

当归补血汤具有保护血管内皮、提高机体免疫、增强心肌收缩力、益气生血的功效，对溃疡、溃后脓血等具有良好的治疗效果。目前，当归补血汤已被用于临床糖尿病足患者的治疗中，但其在DFU中的作用机制尚不清楚[11]。临床研究发现，在DFU患者中VEGF含量减少，血管丰度降低[9,12]。有研究表明，在病毒性心肌炎模型中，当归补血汤可显著升高VEGF表达量，促进血管再生，改善心肌缺血[13]。本研究结果发现，当归补血汤可增加HUVECs VEGF的表达，促进细胞迁移及体外创口的愈合。NO是由iNOS催化合成的血管生成物质之一，NOS活性的增高与血管生成密切相关[14]。在炎症状态下iNOS高表达，而使用竞争性抑制剂抑制iNOS可减少胶原沉积，阻碍创口愈合过程[15]。在心肌梗死模型中，当归补血汤可促进冠状动脉新血管形成，其作用机制与提高VEGF和NO的含量有关[16]。本研究结果发现，当归补血汤在体外创口愈合模型中可提高HUVECs的iNOS活性，增加NO的产生。综合既往研究和本研究结果，推测当归补血汤作用靶点与血管生成有密切关系。但本研究仅从动物体外模型中探究了当归补血汤对血管生成的影响。因此，当归补血汤在分子作用机制及动物乃至人体体内的药效研究还有待更进一步地深入研究。

综上所述，在DFU体外创口愈合模型中，当归补血汤可通过增加VEGF的表达，促进iNOS合成从而上调NO血管调控分子的表达，加速创口的愈合。本研究结果进一步丰富了当归补血汤治疗DFU的作用机制。