紫甘蓝花青素智能指示膜的制备及其在牛乳新鲜度监测中应用

陈赛艳，赵正禾，胥小清，余惠容，何宾宾，刘 潍，王璐瑶，冀俊杰

·农产品加工工程·

紫甘蓝花青素智能指示膜的制备及其在牛乳新鲜度监测中应用

陈赛艳1，赵正禾1，胥小清1，余惠容1，何宾宾1，刘 潍1，王璐瑶1，冀俊杰2

（1. 四川农业大学食品学院，雅安 625014；2. 山东技师学院，济南 250200）

为研究不同紫甘蓝花青素含量对大豆分离蛋白基智能指示膜性能的影响，提高指示膜的综合包装性能，考察指示膜对巴氏杀菌乳新鲜度的监测效果。以大豆分离蛋白（Soy Protein Isolate，SPI）为原料，添加紫甘蓝花青素（Purple Cabbage Anthocyanins，PCA）制备指示膜，对其结构、热性能、机械性能、色度及其稳定性和pH敏感性进行表征和分析，并将指示膜应用于巴氏杀菌乳新鲜度监测中。结果表明：相对于SPI/Na2SO4膜，含有质量分数4%紫甘蓝花青素的指示膜，拉伸强度从2.46 MPa增加到3.77 MPa，断裂伸长率从105.36%增加到131.96%；与标准白的色差从21.13增加到52.88，指示膜明度降低，色度偏黄绿色，结晶温度比SPI/Na2SO4膜升高。指示膜的色度在常温下5 d内不出现可视性色差，但pH敏感性强。将指示膜应用于巴氏杀菌乳新鲜度监测中，指示膜的颜色随着牛乳变质由绿变红，指示膜与原始膜的色差变化与巴氏杀菌乳的pH值变化呈相反趋势，且色差可见。因此，该指示膜具有监测巴氏杀菌乳腐败过程的潜力，应用前景广阔。

膜；包装；大豆分离蛋白；紫甘蓝花青素；pH指示膜；新鲜度监测；巴氏杀菌乳

0 引 言

食品腐败会降低食品的营养，甚至产生有毒成分，危害人体健康。以巴氏杀菌乳为例，微生物在储存过程中大量生长繁殖，极易使巴氏杀菌乳失去初始营养价值和商品价值，还易导致食源性疾病，危害人体健康[1]。随着社会发展和人们生活水平提高，人们对食品营养和安全的要求逐渐提高。因此，迫切需要一种简单可行的方法来监测食品新鲜度的变化。

指示性包装是智能化包装领域的一项新技术，能够利用食品的代谢产物作为信息来执行感测、跟踪和记录等功能，消费者无需打开包装即可观察到包装内食品新鲜度变化，检测成本低且可实时监测[2]。近年来，随着白色污染的加剧和世界能源的日渐短缺，绿色、环保、可生物降解的智能指示膜备受关注。

大豆分离蛋白（Soy Protein Isolate，SPI）作为多羟基天然高分子聚合物，分子中含有大量的氢键、疏水键和疏水作用的基团，具有优异的成膜性、生物相容性、生物降解性和低成本性[3]，常被选为成膜基材。但纯SPI膜脆性大、机械强度不足，常与增塑剂、还原剂等共混，同时通过热处理、碱处理以改善性能[2]，达到扩大包装应用的目的。智能指示膜的制备除了需要成膜基材外，还需要指示剂。目前，已有学者在食品包装材料中添加对pH敏感的合成指示剂制备智能指示膜，如溴甲酚绿、甲基红和溴甲酚紫。这类指示剂对颜色响应显著且迅速，但具有潜在毒性，存在安全隐患，因此亟需寻找一些安全的合成指示剂替代品[4]。

紫甘蓝花青素（Purple Cabbage Anthocyanins，PCA）作为天然指示剂，安全、无毒、对环境pH值敏感，在不同pH环境下呈现不同结构和颜色[5]，因此，富含紫甘蓝花青素的包装膜具有作为食品新鲜度监测膜的潜力。目前，紫甘蓝花青素作为pH指示剂在智能指示膜中的应用已被前人所研究。刘丹飞[6]以聚乙烯醇/羧甲基纤维素钠为成膜基材，紫甘蓝花青素为pH指示剂，制备了智能指示膜并成功应用于猪肉和虾新鲜度监测，发现含紫甘蓝花青素的指示膜在猪肉和虾新鲜度监测过程中都表现出明显的颜色变化，且花青素含量较低的指示膜颜色响应迅速，指示效果明显，更适合在常温下监测猪肉和虾新鲜度的变化。王艳娟[7]以壳聚糖/木薯淀粉为成膜基材，紫甘蓝花青素为pH指示剂，制备了智能指示膜并成功监测了鹿肉新鲜度，鹿肉腐败过程中薄膜颜色从淡粉色变为黄绿色。Guo等[8]制备了一种基于果胶的紫甘蓝花青素指示膜，用于监测羊肉新鲜度，羊肉腐败过程中薄膜颜色从紫红色变为淡蓝色，指示膜色差显著，监测效果良好。目前虽有较多关于大豆分离蛋白复合膜负载紫甘蓝花青素制备智能指示膜的研究，但此类指示膜多应用于肉（猪肉、鱼肉、鹿肉、羊肉等）及肉制品的新鲜度检测中，这与花青素的pH响应范围和肉制品变质过程中的微生物繁殖引起的环境变化有关。而将此指示膜应用于巴氏杀菌乳新鲜度监测中的研究鲜有相关报道。

本研究为了制备具有pH指示功能的大豆分离蛋白膜并研究其应用效果，以大豆分离蛋白为成膜基材，添加紫甘蓝花青素为指示剂制备pH指示膜，应用于巴氏杀菌乳新鲜度监测中，重点考察紫甘蓝花青素指示膜在巴士杀菌乳腐败变质过程中的指示机理，以期为紫甘蓝花青素智能指示膜的研究及应用提供理论指导和数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白（食品级纯度），哈尔滨高科技大豆食品有限公司；紫甘蓝花青素（食品级纯度），济南鲁源生物科技有限公司；巴氏杀菌乳：成都新希望乳业股份有限公司。

无水亚硫酸钠、甘油、氢氧化钠（分析纯），成都市科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

HD-B609B-S智能电子拉力试验机，海达国际仪器有限公司；SC-10便捷式色差仪，苏州欣美和仪器有限公司；WGW光电雾度仪，上海仪电物理光学仪器有限公司；ZUS-4厚度测试仪，长春月明小型试验机有限责任公司；LRH-150智能生化培养箱，上海飞越仪器有限公司；NICOLETIS10傅里叶变换红外光谱仪，美国赛默飞尼高力仪器有限公司；pHS-25酸度计，成都世纪方舟科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 指示膜的制备

根据文献[9-10]的方法稍作调整。将7 g大豆分离蛋白溶于93 g蒸馏水中，加入2%甘油（质量分数，基于SPI水溶液计）作指示剂，机械搅拌20 min，加热到60 ℃,恒温水浴30 min。加入0.1%亚硫酸钠（质量分数，基于SPI水溶液计）作还原剂，25 ℃下恒温搅拌40 min。加入3%、4%和5%（质量分数，基于大豆分离蛋白质量计）紫甘蓝花青素，在常温下、10 000 r/min的转速下均质10 min，得到含不同浓度紫甘蓝花青素的混合液，再用1 mol/L的NaOH溶液调节pH值为9，于0.09 MPa真空环境中常温脱气1 h，制得成膜液。取85 mL成膜液流延至（15 cm×25 cm）有机玻璃板上，40 ℃下恒温干燥7 h，揭膜，置于（25±2） ℃、55%±1%相对湿度的环境中平衡24 h，待测。其中不加花青素的膜标记为SPI/Na2SO4，与不添加亚硫酸钠和花青素均的SPI膜，均作为对照膜。

1.3.2 指示膜性能测定与分析

1）机械性能：按照国标方法GB/T 1040.3—2006测定指示膜的拉伸强度和断裂伸长率[11]。

2）色度与透明度：按照国标方法GB/T 7921—2008测定指示膜的色度，并按式（1）计算色差Δ[12]。

式中、、为膜的色度值，0=99.49，0=-0.07，0=-0.16为标准白的色度值。

按照国标方法GB/T 2410—2008测定指示膜的透明度[13]。

3）红外光谱分析：将膜样裁成2 cm×2 cm试样，在60 ℃条件下干燥24 h，利用傅里叶变换红外光谱仪测定薄膜的吸收光谱，扫描范围650～4 000 cm-1，光谱分辨率4 cm-1，扫描次数32次[3]。

4）差示扫描量热分析：根据许安的方法做少量修改[14]。在氮气环境下，以10 ℃/min的速率从20 ℃升温至250 ℃，测定并分析。

5）扫描电镜分析：将膜样裁成2 cm×2 cm试样，在60 ℃干燥24 h，用液氮将膜冷冻断裂，真空溅射喷金，通过扫描电子显微镜（SEM，Scanning Electron Microscopy）观察膜的横截面（放大500倍）及表面（放大3 000倍），加速电压为5～15 kV[15]。

6）pH值响应将指示膜裁剪成3 cm×3 cm，浸于pH值2、4、6、8、10、12的缓冲溶液中，通过数码相机每5 min拍照一次，记录膜的颜色变化，直至指示膜颜色稳定。同时采用上文中的方法测定膜的色度值并计算色差值，研究指示膜的pH敏感性。

7）颜色稳定性

储藏温度对薄膜颜色稳定性的影响：将指示膜置于相对湿度为75%±1%，自然光照，温度分别为37、25 ℃环境中，利用便携式色差仪按一定的时间间隔测定薄膜的色度值（，，），总时长为10 d。

储藏光照对薄膜颜色稳定性的影响：将指示膜分别置于室内避光（用黑色自封袋）和自然光照（透明自封袋）环境中，相对湿度为75%±1%，温度为25 ℃，利用便携式色差仪按一定的时间间隔测定薄膜的色度值（，，），总时长为10 d。

在测试薄膜的颜色稳定性时，将样品膜的色度值与初始膜的色度值进行对比，计算色差，即式（1）中0，0，0采用初始膜的色度值。

1.3.3 指示膜的应用

根据前人的研究，将pH值、酸度和菌落总数作为巴士杀菌乳的新鲜度指标[16]。准确移取25 mL巴氏杀菌乳样品置于培养皿中。将指示膜裁成大小为3 cm×3 cm的小块，贴于培养皿顶部内表面，指示膜不与杀菌乳接触。用保鲜膜包裹后置于（37±2）℃恒温培养箱中贮藏。每隔3 h采用pHS-25酸度计测定巴氏杀菌乳的pH值，根据GB 4789.2—2022《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》和平板计数法测定巴氏杀菌乳的菌落总数[17-18]，根据GB 5009.239—2016《食品安全国家标准食品酸度的测定》测定巴氏杀菌乳的酸度[19]，同时拍照记录指示膜的颜色和测定指示膜的色度，并根据上文的方法计算膜的色差值。

1.3.4 数据处理

试验数据使用SPSS 26.0、Origin 2019进行处理与分析，结果以平均值±标准差表示。显著性分析用方差分析法（ANOVA），<0.05表示存在显著差异。

2 结果与分析

2.1 指示膜的红外光谱分析

图1是薄膜的红外光谱图。在大豆分离蛋白膜中，在3 100～3 500 cm-1处有一段较宽的吸收谱带，来源于O-H拉伸振动和N-H伸缩振动产生的多重吸收峰[20]，以及SPI分子内部及其分子间-H、O-H、C-H键的伸缩振动[21]。在2 800～3 000 cm-1处有一段较窄的吸收谱带，这是聚合物基质饱和C-H键的伸缩振动所产生的拉伸振动峰[20]。3 289 cm-1处是O-H键的伸缩振动和N-H键的弯曲振动吸收峰，2 959 cm-1处是C-H键的吸收峰[20]，1 632 cm-1处是C=O键的伸缩振动峰来自于酰胺Ⅰ带[21]，1 539 cm-1处是N-H键的弯曲振动吸收峰来自酰胺Ⅱ带[22]，1 400 cm-1处是C-OH伸缩振动吸收峰来自于酰胺Ⅲ带[5]，1 235 cm-1处为C-N和N-H的伸缩振动峰，1 110 cm−1处吸收峰表示C-H键、O-CH键的变形振动[23]。加入亚硫酸钠后，2 880 cm-1处的饱和C-H键的伸缩振动加强，这是由于亚硫酸钠作为还原剂，打断了大豆分离蛋白分子间的S-S键，暴露了分子内部疏水基团，削弱了复合膜的分子间力。加入花青素之后，3 289 cm-1处的波峰向低波数偏移，这是由于大豆分离蛋白与紫甘蓝花青素之间产生氢键作用[24]，同时大豆分离蛋白链上羟基的O电负性大，与多酚羟基上的H发生静电吸引作用，使-OH的电子更偏向O，-OH共价键被拉伸，H周围的电子云密度降低，羟基峰向低波数偏移[22]。添加紫甘蓝花青素后指示膜的红外图谱与大豆分离蛋白膜的红外图谱峰形相似，指示膜的O-H伸缩振动峰向右偏移，说明花青素与大豆分离蛋白之间为物理结合，花青素的加入并未破坏大豆分离蛋白的基本结构，主要通过非共价键（氢键或者疏水相互作用）结合。1 539 cm-1处由N-H键的弯曲振动产生的吸收峰在加入紫甘蓝花青素之后向左发生偏移，说明添加花青素对复合膜的N-H有明显影响[24]。以上结果说明花青素与大豆分离蛋白之间具有较好的相容性。

注：SPI膜为纯SPI膜，SPI/Na2SO4膜为SPI中加入Na2SO4的复合膜，SPI/Na2SO4/PCA 3膜、SPI/Na2SO4/PCA 4膜和SPI/Na2SO4/PCA 5膜分别为含质量分数3%、4%、5%紫甘蓝花青素的指示膜。下同。

2.2 指示膜的扫描电镜分析

利用扫描电镜观察指示膜的微观结构，如图2。SPI膜具有光滑、均匀的表面和横截面结构，表明大豆分离蛋白成膜性良好。加入少量紫甘蓝花青素后，指示膜表面和内部均出现少量颗粒和团聚的现象，但无裂痕，这可能是由带正电的紫甘蓝花青素分子与带负电的大豆分离蛋白分子之间的相互吸引出现的少量颗粒[25]，同时表面出现了少量的粗糙。随着紫甘蓝花青素含量增加，指示膜的截面出现较多的颗粒，表面的颗粒和团聚状物也随之增加，表明紫甘蓝花青素与大豆分离蛋白的融合已经饱和，过量的花青素分子浮于指示膜表面。故选择紫甘蓝花青素与SPI基质融合良好、指示膜均匀性和致密性佳的PCA4%添加量的指示膜进行分析，因为致密的结构有可能改善薄膜的机械性能和阻隔性能，同时均匀、致密的微观结构也有利于提高消费者对商品的青睐。

图2 指示膜的扫描电镜图

2.3 指示膜的热稳定性分析

指示膜的热稳定性在一定程度上影响其应用。本研究通过差式扫描量热法（Differential scanning calorimetry，DSC）分析指示膜的热稳定性，结果如图3所示。有研究显示，纯SPI 膜的熔融温度为87.26 ℃[10]。本研究中SPI膜中加入亚硫酸钠后在167 ℃处出现吸热峰，发生熔融；添加质量分数3%紫甘蓝花青素后，结晶温度升高了3 ℃，达到170 ℃，且随着PCA含量增加，结晶温度继续升高。这可能是一定量的亚硫酸钠作为还原剂增强了SPI膜的结构致密性，使其熔融温度升高；而PCA与SPI分子间强烈的作用力，需要更多的热能方可对其进行解离。而PCA含量较低时，PCA与SPI分子间的相互作用力较弱，随着PCA含量增加，分子间作用力增加，同时SPI与PCA分子间形成的氢键也可以提高复合膜的热稳定性，这与红外图谱的分析一致。当花青素含量继续增加时，熔点稍有降低，如从4%添加量时的194 ℃下降到5%添加量时的190 ℃，同时在添加过量的花青素之后的指示膜不再出现单一精确的熔融点，而是形成了宽的软化带，这可能与过量花青素在指示膜表面分布不均有关[10,25]，这种不均会降低指示膜的结构稳定性，进而出现宽的软化温度区间。

图3 指示膜的DSC曲线

2.4 指示膜的厚度与机械性能分析

指示膜厚度与膜液浓度、膜液溶质中分子结构及成膜过程中的相互作用以及成膜面积有关[3]。本研究中成膜面积固定，膜液浓度随着PCA含量增加而升高。这是因为添加的PCA增加了成膜液的干物质含量，导致相同量的成膜液流延时质量增加，从而指示膜的厚度增加[26]。当PCA增加到一定量时，膜的厚度趋于稳定，整个厚度在115.67～144.91 μm之间。这是因为PCA与SPI具有良好的相容性，小分子进入SPI大分子的间隙中，膜的内部结构均匀而固定，这一点在红外光谱分析中得到了证实。过量的PCA分子不会进入SPI大分子间，故膜的厚度增加不显著。

在指示膜的应用中，需要将指示膜覆盖于巴士杀菌乳的包装容器出口处，良好的机械性能可保障巴士杀菌乳包装的完整性和安全性，尤其是在运输过程中[27]。指示膜的机械性能如表1所示，相比于添加亚硫酸钠的SPI膜（2.46 MPa），含PCA的指示膜拉伸强度（TS，Tensile strength）和断裂伸长率（EAB，Elongation At Break）均较高，这与Huang的研究结果一致[28]。且随着PCA浓度增加，指示膜的TS先增后减，EAB递减。这可能是因为三方面的原因：一是添加PCA后，PCA与SPI相容性佳，混合均匀，提升了复合膜的结构致密性；二是带正电的PCA分子与带负电的SPI分子之间由于静电作用、氢键作用形成了高密度的空间立体网络[25]；三是PCA中大量的羟基与SPI分子之间产生了强的相互作用，阻碍了SPI分子的链段运动，从而TS增加。而PCA增加到一定量时，过量的PCA小分子浮于指示膜表面发生自身聚集，削弱了SPI网络结构中的键合作用，使指示膜的TS降低。这与前人研究结果的规律一致[25]。但由于该指示膜中添加了具有还原性和漂白性的亚硫酸钠，亚硫酸钠小分子进入SPI大分子间增强了指示膜的结构致密性和机械性能，漂白作用增强了指示膜的白度，降低其显色效果。故添加花青素后，膜的显色响应会更显著，导致了少量花青素的显色效果与前人研究中添加较多花青素的显色效果相当。这也是本文中花青素添加量少于前人研究的原因所在。同时过量PCA的加入使得指示膜的分子空隙更小，与水分子之间的交联更少，从而EAB变小[6]。但本研究指示膜断裂伸长率（131.96%）也优于其他含花青素的膜，比如马铃薯淀粉/硫酸软骨素/蓝莓花青素复合膜（42.15%）[29]、大豆分离蛋白/纳米氧化锌/葡萄皮红复合膜（113.29%）[3]。以上结果说明，PCA在SPI膜的添加量选择4%为宜，此时指示膜的TS比添加亚硫酸钠的SPI膜增加53.25%，EAB比添加亚硫酸钠的SPI膜增加25.25%。

表1 指示膜的厚度和机械性能

注：数值=均值±标准差（=3），同一列中标有不同小写字母表示差异显著（<0.05），下同。

Note: Values are presented as mean±standard deviation. Different letters in the same column indicate significant differences (<0.05), the same below.

2.5 指示膜的色度与环境稳定性分析

一般来说，指示膜应用于食品包装和销售过程中，膜的色度直接影响食品的感官效果和消费者接受度，膜的颜色不宜过深，故对指示膜的初始色度进行测试。此时的色差用指示膜的色度与标准白的色度进行对比，色差越低，表明指示膜颜色浅，更适合于销售。指示膜的色度如表2所示，相比于SPI膜，含PCA的指示膜值和值较小，值和Δ值均较大，说明指示膜偏绿偏黄。随着PCA浓度增加，指示膜的颜色从淡黄色转变为墨绿色，不利于销售。但若指示剂含量过低，则指示膜的变色响应不够灵敏，不能满足应用的要求[2]。透明度直接影响食品的感官效果，由表2可见，添加紫甘蓝花青素显著降低了指示膜的透明度，但均在消费者可接受的范围内，故在确保指示膜可接受透明度和pH敏感性响应的双重前提下，选择4%的PCA添加量为宜。

表2 指示膜的色度

为准确传递所监测食品的新鲜度信息，必须确保指示膜在食品保质期内的颜色稳定性，故对指示膜进行温度和光照稳定性分析，此时色差用指示膜的实时色度与初始色度相比较。而花青素的稳定性易受到温度、光照等环境的影响[30]。图4显示了指示膜在不同温度、光照环境下的颜色稳定性。与在37℃下相比，25℃环境下的指示膜显示出更高的稳定性，Δ值更低，这与前人的研究结果一致[30]。这是因为对花青素具有保护作用的3-糖苷结构在高温下易水解，同时花青素吡喃环也会水解，整个花青素结构被破坏，薄膜颜色发生改变[31]。Δ>5时，薄膜显示出肉眼可见的颜色变化[32]。

光照也是影响薄膜颜色的重要参数，长时间的光照会诱发花青素碳骨架在C2位断裂，形成C4羟基降解的中间产物，之后被氧化成查尔酮，查尔酮进一步氧化成如苯甲酸和2，4，6-三羟基苯甲醛等水解产物[33]，同时光照引起的样品表面温度升高也会引起花青素的分解。由图4c和d可见，相比于光照条件下，避光下的指示膜显示出相对较高的颜色稳定性，尤其是PCA-4在光照条件下120 h内颜色稳定（Δ<5），在避光条件下132 h内颜色稳定（Δ<5），这得益于SPI的亲水中心与紫甘蓝花青素结合，在避光条件下具有良好的水合作用，从而减少了PCA分子水合降解的机会，同时SPI分子的三维网络结构对PCA具有一定的包裹作用[34]。同时不论是光照条件下还是避光条件下，指示膜的颜色稳定时长均超过了5 d，符合巴氏杀菌乳的包装监测要求。

注：PCA 0膜为SPI中加入Na2SO4而不含花青素的复合膜；PCA 3膜、SPCA 4膜和PCA 5膜分别为含质量分数3%、4%、5%紫甘蓝花青素的指示膜。

2.6 指示膜的pH敏感性分析

根据上述分析，选择PCA-4指示膜浸泡在不同pH值的酸碱缓冲液中以颜色变化评估指示膜的pH敏感性。指示膜的颜色变化见表3。当pH值为2时，指示膜呈红色。随着pH值升高，指示膜红色减淡，这是因为紫甘蓝花青素此时近乎无色。碱性条件下指示膜颜色变深，当pH值>12，指示膜呈现黄绿色。这是由于花青素在不同pH环境下呈现的不同结构所致[35]。当花青素在pH值为2～4的强酸性环境中时，以红色黄烊盐离子为主；随着pH值升高，PCA失去碳氧环上的阳离子，并与水中的OH-离子结合后形成无色甲醇假碱，红色逐渐变淡；pH值继续升高，花青素中的黄酮离子发生水合作用形成了无色的查尔酮结构[36]，指示膜颜色变淡；在碱性溶液中，PCA部分结构极不稳定，黄烊盐离子失去质子，蓝色醌式碱逐渐增加，PCA呈现蓝绿色。如表3所示，在pH值2-12之间，指示膜的值先增大后减小；值逐渐降低，即颜色由红（+）到绿（-）的变化趋势；值先减小后增大，但始终为正。同时表3数据表明，pH值4-8范围内指示膜与初始膜（=46.96，=-4.60，=3.76）的色差值为18.66～21.12，通常认为当色差Δ值>5时，该颜色变化可被肉眼识别；Δ值>12时，则表示不同的颜色空间[37]。本研究中的指示膜在pH值4～8颜色变化灵敏，具备监测巴氏杀菌乳新鲜度的潜力。

2.7 指示膜在监测巴氏杀菌乳新鲜度中的应用

巴氏杀菌乳在腐败变质过程中，微生物的生长会导致乳酸累积，降低pH值。实际检测中，常以酸度和pH值作为巴氏杀菌乳新鲜度的重要指标[38]。本研究中，将巴氏杀菌乳贮藏于37 ℃的恒温培养箱中，每隔3 h检测巴氏杀菌乳的酸度和pH值，以及指示膜的色差。将指示膜的初始色度（=46.96，=-4.60，=3.76）作为对照，经过不同时间测定的指示膜色度与初始色度进行对比，根据式（1）计算得到各个时间点指示膜与原始膜的色差值，结果见表4。巴氏杀菌乳的初始酸度值为12.12°T，随着时间延长，酸度值持续增加，且速度越来越快；同时pH值持续降低，尤其是18 h后，巴氏杀菌乳的pH降至5.84，这是由于微生物代谢产生的乳酸积累所致。根据前人的研究结论，乳酸菌在pH值较低的4.0～5.0时，会导致牛奶出现不良变质[39]。同时检测指示膜的色差值，发现指示膜与初始膜的色差逐步增加，与2.6节中指示膜在不同pH值条件下的颜色响应行为一致，如图5a所示，指示膜的颜色由绿色逐渐变成红色。贮存初期（<9 h）新鲜牛乳中的乳糖在微生物作用下分解成丙酮酸，在氧气充足时被氧化成二氧化碳和水，同时也由于乳糖未被大量分解，牛乳酸度增长缓慢；而后期在氧含量不足时丙酮酸无法即时转化而发生堆积，于是乳酸脱氢酶将丙酮酸还原成乳酸（图5b），导致变质牛乳的酸度增长越来越快，同时整个巴士杀菌乳的环境呈酸性[40]。此时指示膜处在酸度增加的环境中，产生的显色反应由紫甘蓝花青素的结构变化所致。紫甘蓝黄花青素的反应平衡可以通过Handerson-Hassel-Balch方程进行分析和证明（图5c）[39]。

表3 不同pH值条件下指示膜的颜色响应

表4 巴氏杀菌乳酸度、pH值和指示膜的色差变化

图5 巴氏杀菌乳腐败过程中指示膜色度变化原理

在巴士杀菌乳的保鲜初期，花青素中的黄素阳离子（红色）脱除质子形成醌式碱（紫色）/阴性醌式碱（蓝色）[41]，指示膜呈现蓝色或紫色，但本研究中的巴士杀菌乳酸性为主，碱性不足，故指示膜只在6 h内呈青色；随着巴士杀菌乳酸性增强，黄素阳离子的双键在周围环境中发生扩展共轭，形成无色甲醇假碱和查尔酮，逐渐显示出黄素阳离子的本色，红色[42]，表现为指示膜在24 h内以黄色/红色系为主（图5a）。因此，在贮存时间达9 h时，指示膜与前一个相邻贮存时间的色差值为10.27，与初始膜的色差为18.52；贮藏时间达12 h后指示膜与初始膜的色差值继续增大，巴氏杀菌乳的酸度值已经超过国家标准所规定的范围12～18 °T[43]，菌落总数也超过了50 000 CFU/mL[43]，巴氏杀菌乳呈不新鲜状态，指示膜的颜色由绿变红。黄正农等[44]提取甘蓝红添加到塔拉胶膜基质中，制备指示膜研究其在巴氏杀菌乳体系中的应用时，与本研究结果相似。本研究中，当贮存时间超过18 h后，巴氏杀菌乳出现凝乳状态，已经完全变质，同时pH值显著下降，酸度值上升，菌落总数超过国家安全标准[43]，巴氏杀菌乳发出酸败气味，指示膜红色加深，Δ值为17.33，视觉观察明显。通常情况下，色差大于5即可肉眼识别[14]，本研究中指示膜与初始膜的色差值均大于5，表明色差可见。根据前人的研究成果，包含有葡萄皮红花青素的pH指示膜在监测新鲜牛奶和变质牛奶时的颜色分别为黄色、略深和略红，与本文的研究结果有相似之处[45]。表明本研究具有一定的科学性和实践价值。

3 结 论

1）紫甘蓝花青素（Purple Cabbage Anthocyanins，PCA）加入大豆分离蛋白（Soy Protein Isolate，SPI）中，与SPI通过氢键和静电相互作用交联，提高了PCA/SPI指示膜的机械性能。PCA添加量为4%较为合适，与不添加PCA的SPI/Na2SO4膜相比，添加了4%花青素的指示膜拉伸强度上升了53.25%，断裂伸长率上升了25.25%。

2）相比较于 SPI 膜，含PCA的指示膜热稳定性增强不明显。PCA在SPI内融合均匀，但在膜表面分布不均。

3）指示膜具备良好的透明度和环境稳定性，5 d内色差不可见。pH敏感性强，在不同的pH值环境下色差可见。

4）指示膜在巴氏杀菌乳新鲜度检测中应用效果良好，随着巴氏杀菌乳腐败变质，指示膜与原膜的色差均大于5，色差可见。该指示膜具有作为指示标签用于牛乳新鲜度可视化监测的潜能。

[1] Ma Y L, Li S Y, Ji T T, et al. Development and optimization of dynamic gelatin/chitosan nanoparticles incorporated with blueberry anthocyanins for milk freshness monitoring[J]. Carbohydrate Polymers, 2020, 247: 116738.

[2] Ran R M, Chen S Y, Su Y H, et al. Preparation of pH-colorimetric films based on soy protein isolate/ZnO nanoparticles and grape-skin red for monitoring pork freshness[J]. Food Control, 2022, 137: 108958.

[3] 冉锐敏，王璐瑶，何宾宾，等. 纳米氧化锌/葡萄皮红改性大豆分离蛋白膜的制备与性能研究[J]. 农业工程学报，2021，37(14)：294-301.

Ran Ruimin, Wang Luyao, He Binbin, et al. Preparation and characterization of soy protein isolate films modified by ZnO nanoparticles and grape-skin red[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(14): 294-301. (in Chinese with English abstract)

[4] Liu X Y, Chen K K, Wang J Y, et al. An on-package colorimetric sensing label based on a sol-gel matrix for fish freshness monitoring[J]. Food Chemistry, 2020, 307(C): 125580-125580.

[5] Yong H M, Liu J, Kan J, et al. Active/intelligent packaging films developed by immobilizing anthocyanins from purple sweet potato and purple cabbage in locust bean gum, chitosan and κ-carrageenan-based matrices[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2022, 211: 238-248.

[6] 刘丹飞. 花青素智能比色膜的制备及其在新鲜度检测中的应用[D]. 株洲：湖南工业大学，2021.

Liu Danfei. Preparation of Anthocyanin Intelligent Colorimetric Films and Application in Freshness Detection[D]. Zhuzhou: Hunan University of Technology, 2021. (in Chinese with English abstract)

[7] 王艳娟. 用于鹿肉新鲜度检测的天然色素指示标签的研究[D]. 哈尔滨：东北林业大学，2019.

Wang Yanjuan. Study on Natural Pigment Indicator labels for Venison Freshness Detection[D]. Harbin: Northeast Forestry University, 2019. (in Chinese with English abstract)

[8] Guo Z L, Zuo H X, Ling H, et al. A novel colorimetric indicator film based on watermelon peel pectin and anthocyanins from purple cabbage for monitoring mutton freshness[J]. Food Chemistry, 2022, 383: 131915.

[9] 王璐瑶，何淑蹇，冉锐敏，等. 基于Plackett-Burman试验设计筛选大豆分离蛋白膜制备的主要工艺因素[J]. 中国油脂，2021，46(11)：73-77.

Wang Luyao, He Shujian, Ran Ruimin, et al. Screening of main process factors impacting the comprehensive performance of soy protein isolate film using Plackett-Burman design[J]. China Oils And Fats, 2021, 46(11): 73-77. (in Chinese with English abstract)

[10] 陈成，李蕾，毕会敏，等. 紫甘蓝花青素/大豆分离蛋白复合膜的制备与性能研究[J]. 西部林业科学，2022，51(3)：67-73

Chen Cheng, Li Lei, Bi Huimin, et al. Preparation and characterization of purple cabbage anthocyanins/soy protein isolate composite film[J]. Journal of West China Forestry Science, 2022, 51(3): 67-73. (in Chinese with English abstract)

[11] 国家质量监督检验检疫总局. 塑料拉伸性能的测定第3部分薄膜和纸片的试验条件：GB/T 1040. 3-2006[S]. 北京：中国标准出版社，2006.

[12] 国家质量监督检验检疫总局. 均匀空间与色差公式：GB/T 7921-2008[S]. 北京：中国标准出版社，2008.

[13] 国家质量监督检验检疫总局. 透明塑料透光度和雾度的测定：GB/T 2410-2008[S]. 北京：中国标准出版社，2008.

[14] 许安，刘淑强，吴改红，等. 生物可降解 PLLA/PGA复合膜的力学性能及热性能研究[J]. 塑料科技，2017，45(1)：69-73.

Xu An, Liu Shuqiang, Wu Gaihong, et al. Study on mechanical and thermal properties of biodegradable PLLA/PGA composite film[J]. Plastics Science and Technology, 2017, 45(1): 69-73. (in Chinese with English abstract)

[15] 汪敏，陈洁莹，徐磊，等. 竹叶抗氧化物/酪蛋白酸钠/乳清分离蛋白可食膜的制备和性能分析[J]. 食品科学，2021，42(3)：266-272.

Wang Min, Chen Jieying, Xu Lei, et al. Preparation and performance analysis of bamboo leaf antioxidant/sodium caseinate/whey protein isolate composite edible film[J]. Food Science, 2021, 42(3): 266-272. (in Chinese with English abstract)

[16] Mohsen M G, Mehran M, Hossein T, et al. Development of an easy-to-use colorimetric pH label with starch and carrot anthocyanins for milk shelf life assessment[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2020, 153: 240-247.

[17] 李艳肖，胡雪桃，张芳，等. 基于高光谱技术的菌落图像分割与计数[J]. 农业工程学报，2020，36(20)：326-332.

Li Yanxiao, Hu Xuetao, Zhang Fang, et al. Colony image segmentation and counting based on hyperspectral technology[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(20): 326-332. (in Chinese with English abstract)

[18] 国家市场监督管理总局. 食品微生物学检验菌落总数测定：GB 4789. 2-2022[S]. 北京：中国标准出版社，2022.

[19] 国家卫生和计划生育委员会. 食品安全国家标准食品酸度的测定：GB 5009. 239-2016[S]. 北京：中国标准出版社，2016.

[20] Han Y, Yu M, Wang L. Preparation and characterization of antioxidant soy protein isolate films incorporating licorice residue extract[J]. Food Hydrocolloids, 2018, 75: 13-21.

[21] 王振国，高育哲，时家峰，等. 挤压温度对大豆分离蛋白与原花青素复合物结构和功能特性的影响[J]. 农业工程学报，2022，38(21)：279-286.

Wang Zhenguo, Gao Yuzhe, Shi Jiafeng, et al. Effects of extrusion temperature on the functional and structural properties of soybean protein isolate and proanthocyanidin complex[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2022, 38(21): 279-286. (in Chinese with English abstract)

[22] Koshy R R, Reghunadhan A, Mary S K, et al. pH indicator films fabricated from soy protein isolate modified with chitinnanowhisker and Clitoria ternatea flower extract[J]. Current Research in Food Science, 2022, 5: 743-751.

[23] Martelli-tosi M, Assis O B G, Silva N C, et al. Chemical treatment and characterization of soybean straw and soybean protein isolate/straw composite films[J]. Carbohydrate Polymers, 2017, 157: 512-520.

[24] 张淑瑜，陈春秀，李国英．胶原/氧化羟丙基甲基纤维素复合膜的制备与表征[J]．现代食品科技，2022，38(1)：248-255.

Zhang Shuyu, Chen Chunxiu, Li Guoying. Preparation and characterization of collagen/dialdehyde hydroxypropyl methylcellulose composite films[J]. Modern Food Science and Technology, 2022, 38(1): 248-255. (in Chinese with English abstract)

[25] Yong H M, Liu J. Recent advances in the preparation, physical and functional properties, and applications of anthocyanins-based active and intelligent packaging films[J]. Food Packaging and Shelf Life, 2020, 26: 100500-100517.

[26] Qin Y, Liu Y, Yong H, et al. Preparation and characterization of active and intelligent packaging films based on cassava starch and anthocyanins from Lycium ruthenicum Murr[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2019, 134: 80-90.

[27] Rambabu K, Bharath G, Banat F, et al. Mango leaf extract incorporated chitosan antioxidant film for active food packaging[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2019, 126: 1234-1243.

[28] Huang S Y, Xong Y B, Zou Y, et al. A novel colorimetric indicator based on agar incorporated withroot extracts for monitoring fish freshness[J]. Food Hydrocolloids, 2019, 90(5): 198-205.

[29] Bao Y W, Cui H J, Tian J L, et al. Novel pH sensitivity and colorimetry-enhanced anthocyanin indicator films by chondroitin sulfate co-pigmentation for shrimp freshness monitoring[J]. Food Control, 2022, 131: 108441-108453.

[30] 孙倩怡，任珅，鲁宝君，等. 蓝莓花青素的稳定性研究[J]. 营养学报，2017，39(4)：400-404.

Sun Qianyi, Ren Kun, Lu Baojun, et al. Study on the Stability of anthocyains from blueberry[J], Acta Nutrimenta Sinica, 2017, 39(4): 400-404. (in Chinese with English abstract)

[31] Zhang J J, Zou X B, Zhai X D, et al. Preparation of an intelligent pH film based on biodegradable polymers and roselle anthocyanins for monitoring pork freshness[J]. Food Chemistry, 2019, 272: 306-312.

[32] Prietto L, Mirapalhete T C, Pinto V Z, et al. pH-sensitive films containing anthocyanins extracted from black bean seed coat and red cabbage[J]. LWT-Food Science and Technology, 2017, 80, 492-500

[33] Peron D V, Fraga S, Antelo F. Thermal degradation kinetics of anthocyanins extracted from juçara (euterpe edulis martius) and “italia” grapes (L. ), and the effect of heating on the antioxidant capacity[J]. Food Chemistry, 2017, 232: 836-840.

[34] 孙嘉临，袁玉娇，曾涣煌，等. 基于大豆分离蛋白的环境友好型包装材料研究进展[J]. 食品与发酵工业，2019，45(24)：269-277.

Sun Jialin, Yuan Yujiao, Zeng Huanhuang, et al. Research progress of environment-friendly packaging materials based on soy protein isolate[J]. Food and Fermentation Industries, 2019, 45(24): 269-277. (in Chinese with English abstract)

[35] 蒋希芝，徐磊，张蓓，等. 基于生物酶法的酰基化桑椹花青素的制备与特性[J]. 农业工程学报，2021，37(3)：294-301.

Jiang Xizhi, Xu Lei, Zhang Bei et al. Preparation and characterization of acylated mulberry anthocyanins using biological enzyme method[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(3): 294-301. (in Chinese with English abstract)

[36] 孙武亮，李文博，靳志敏，等. 花青素纳米纤维智能标签对羊肉新鲜度的无损检测[J]. 农业工程学报，2021，37(4)：24-30.

Sun Wuliang, Li Wenbo, Jin Zhimin, et al. Non-destructive detection of mutton freshness using anthocyanin nanofiber smart label[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(4): 24-30. (in Chinese with English abstract)

[37] Ezati P, Rhim J W. pH-responsive chitosan-based film incorporated with alizarin for intelligent packaging applications[J]. Food Hydrocolloids, 2020, 102: 105629-105639.

[38] Perez G C, Salvo C C, Martin P F, et al. Analysis of milk using a portable potentiometric electronic tongue based on five polymeric membrane sensors[J]. Frontiers in Chemistry, 2021, 9: 706460.

[39] Gao R C, Hu H L, Shi T, et al. Incorporation of gelatin and Fe2+increases the pH-sensitivity of zein-anthocyanin complex films used for milk spoilage detection[J]. Current Research in Food Science, 2022, 5: 677-686.

[40] 徐楚璇. 牛奶的变质与新鲜度检测探讨[J]. 现代商贸工业，2019，40(10)：176-178.

Xu Chuxuan. Discussion on the detection of milk deterioration and freshness[J]. Modern Business Trade Industry, 2019, 40(10): 176-178. (in Chinese with English abstract)

[41] Priyadarshi R, Ezati P, Rhim J W. Recent advances in intelligent food packaging applications using natural food colorants[J]. ACS Food Science & Technology, 2021, 1: 124-138.

[42] Li Y N, Wu K X, Wang B H, et al. Colorimetric indicator based on purple tomato anthocyanins and chitosan for application in intelligent packaging[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2021, 174: 370-376.

[43] 中华人民共和国卫生部. 食品安全国家标准巴氏杀菌乳：GB 19645-2010[S]. 北京：中国标准出版社，2010：1-5.

[44] 黄正农，刘飞，钟芳. 甘蓝红-塔拉胶膜在巴氏杀菌乳新鲜程度监测中的应用研究[J]. 广东化工，2019，46(7)：107-109.

Huang Zhengnong, Liu fei, Zhong Fang. Study on application of cabbage red-tara gum film for pasteurised milk freshness monitoring[J]. Guangdong Chemical Industry, 2019, 46(7): 107-109. (in Chinese with English abstract)

[45] Ma Q, Wang L. Preparation of a visual pH-sensing film based on tara gum incorporating cellulose and extracts from grape skins[J]. Sensors and Actuators, B Chemical. 2016, 235: 401-407.

Preparation of intelligent indicator film based on purple cabbage anthocyanidin for monitoring milk freshness

Chen Saiyan1, Zhao Zhenghe1, Xu Xiaoqing1, Yu Huirong1, He Binbin1, Liu Wei1, Wang Luyao1, Ji Junjie2

(1.,,625014,; 2.,250200,)

A pH-colorimetric film is one of the most important indicators to acquire straightforward information by the visible color changes without opening packages in the food industry. Among them, purple cabbage anthocyanins (PCA) can be expected to serve as a natural anthocyanin pigment with high pH sensitivity. Different color changes can be easily observed in the pH variation, due to the unique structure. The PCA color can be changed from dark to light red in the acid solutions (pH=2-4) as the dominant flavylium cation. At pH level of 5-6, the flavylium cation can react with the hydrogen, and then transform into the carbinol pseudobase (colorless) or chalcone (colorless) and appeared pink. The quinoidal base can also be established with the increase of pH (7-8). Subsequently, the anion quinoidal (blue) is dominant in the alkalinity pH (9-10). The color can turn greenish-blue for the anionic quinoidal base (blue) that is synthesized at pH 11. Soy Protein Isolate (SPI) (a byproduct of the soybean oil industry) can be used to characterize by its low cost, high biodegradability, biocompatible, and excellent film-forming properties. Also, the SPI, as a natural material is easy to fuse with the purple cabbage anthocyanins. Hence, the SPI can be selected as a film-forming material. However, the SPI films share relatively low mechanical properties and thermal stability, due to the hydrophilic bonds (-OH, -NH2, -COOH, and -SH) in the film matrix. The typical C6-C3-C6 carbon skeleton structure in anthocyanins can contain two benzoyl rings and oxygenated hexameric heterocycles with the cations (a typical 2-phenyl-benzopyran cation structure). Two typical and highly reactive structural in the PCA molecules can cross-link with the SPI molecules via the hydrogen bonds and electrostatic interactions, in order to form the homogeneity and low surface roughness of films, due mainly to the excellent fusibility and compatibility of PCA and SPI, indicating the improved mechanical properties and pH sensitivity of SPI/PCA indicator films. Therefore, this study aims to synthesize the SPI/PCA-based pH-indicator films with a uniform structure, excellent mechanical properties, and strong pH sensitivity, and then apply them to monitor the freshness of pasteurized milk. FTIR and SEM demonstrated that the PCA was successfully dispersed in the SPI film matrix, and then interacted with the SPI molecules under electrostatic interactions and hydrogen bonds. In SEM micro graphs, the number of small particles was observed to float on the surface, while small holes were in the section of indicator films with the overdose PCA. The highest limitation of the fusion degree of PCA with SPI was 4%. PCA significantly enhanced the mechanical properties of indicator films. The tensile strength of indicator films increased by 53.25% (from 2.46 to 3.77 MPa), and the elongation at break increased by 25.25% (from 105.36% to 131.96%), compared with the SPI/Na2SO4film. The thermal stability of indicator films with the PCA was similar to the SPI films (167 to 194℃). The color difference (Δ) of indicator films with the PCA from the standard white increased from 21.13 to 52.88. L value, where the indicator film was yellowish-green. The indicator films presented strong chromatic stability without the visible color difference within 5 days at room temperature. A high pH sensitivity was found with the visible color difference under different pH values. Two properties were beneficial to monitor the freshness of the indicator film. The indicator films were also applied to monitor the milk. The color was then changed from green to red, together with the freshness deterioration of pasteurized milk. Also, the color difference with the initial film was visibility (Δ≥5) at any time. Hence, purple cabbage anthocyanins were used to promote the indicator function of pure SPI films. The indicator films can be used to monitor the freshness of pasteurized milk via color change. Therefore, the indicator films can be widely expected to apply in intelligent packaging, due mainly to excellent pH-sensitive properties and color stability. The finding can provide insightful ideas to design and produce SPI/PCA-based pH-indicator films.

film; packaging; soy protein isolate; purple cabbage anthocyanins; pH indicator film; freshness monitoring; pasteurized milk

10.11975/j.issn.1002-6819.2022.24.025

TS206.4

A

1002-6819(2022)-24-0228-09

陈赛艳，赵正禾，胥小清，等. 紫甘蓝花青素智能指示膜的制备及其在牛乳新鲜度监测中应用[J]. 农业工程学报，2022，38(24)：228-236.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.24.025 http://www.tcsae.org

Chen Saiyan, Zhao Zhenghe, Xu Xiaoqing, et al. Preparation of intelligent indicator film based on purple cabbage anthocyanidin for monitoring milk freshness[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2022, 38(24): 228-236. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.24.025 http://www.tcsae.org

2022-08-01

2022-09-27

四川省科技厅创新苗子工程资助项目（2021106）和四川省科技厅项目（2020YFN0147）资助

陈赛艳，博士，讲师，研究方向为智能化包装材料。Email：ssdj1102@163.com