月季三倍体育种方法概述

丁艳丽 李珍 付涌玉

摘要：为了培育不结果或少结果的藤本月季新品种，降低植株营养消耗，节约管理成本，促进月季开花，提高其观赏性，选定适合的月季品种作为父母本，进行杂交试验。首先对父本花粉生活力和发芽率的测定和母本开花生物学特性的观测，接着开展了有性杂交和播种育苗，最后从形态和DNA方面对杂种进行鉴定。

关键词：三倍体;杂交

现代月季通常指蔷薇科、蔷薇属中一类四季开花的杂种品种群，主要包括四大类：杂种香水月季、丰花月季、微型月季和藤本月季。现代月季经过200多年的发展，已逐渐形成了庞大的类群，特别是欧美及日本等月季发达国家的新品种更是层出不穷，令人瞩目。现代月季的品种群（2n=2x、3x、4x、x、5x、6x、8x），种类繁多，来源广泛。

国内月季育种现状：月季的育种最早始于中国，其最早记录是公元960 年把Rosa chinensis 用于月季杂交。北宋时代，我国月季品种广栽于洛阳、山东、两淮、苏州、扬州等地，当时已经开展播种天然授粉种子并由实生苗中选育新品种的活动。到宋代，仅洛阳就有41个月季品种，达到了世界水平。但是从明代开始我们落伍了，野生资源、古老品种遭到严重破坏和流失，直到不久前我国的月季育种还基本处于停滞或缓慢发展状态。我国月季育种工作开始于新中国成立以后，20世纪50～70年代，我国自育品种‘黑旋风’、‘上海之春’、‘浦江朝霞’相继问世，上海、北京、杭州等地新品种选育工作开始发展。1986年中国月季协会成立后，大力倡导新品种的培育工作，全国许多城市相继成立了月季协会，高校、科研机构以及月季爱好者开始重视月季的育种工作，我国月季育种和发展进入了新时代。1957～2016年的60年间，我国自育新品种共计455个。

植物的多倍体情况在植物界里随处可见，如马铃薯、小麦、棉花、无籽西瓜、香蕉、番茄、巨峰葡萄等等。多倍体育种是指通过人工的方法将植物染色体组进行加倍，或是直接从自然界中选育染色体组加倍的突变体，从而获得新品种的方法。多倍体的特点有巨大性、品质与产量提高、生理特性改变、遗传变异性、不孕性与可孕性等特点。由于多倍体的诸多特点，多倍体育种在植物育种学和分子生物学方面早已成为研究热门。多倍体植物品种的育种方法主要有两大类，一类是植物在自然界中自然加倍，人们根据自己的需求，到自然界中去发现自然加倍的物种，将其直接引种过来;另一类就是通过人工诱导的方法产生。人工诱导多倍体的方法比较多，如使用温度刺激、机械创伤、嫁接、电离辐射、射线等方法诱使植物加倍的物理方法;如使用秋水仙素等化学诱变剂诱导植物加倍;如仿效自然加倍的途径，使用传统杂交技术、组织培养技术、细胞融合技术进行多倍体育种。

目前国内的月季育种目标主要集中在花色育种、花香育种、抗性育种，育种方法主要是杂交育种、诱变育种、分子育种。在国内，月季的倍性育种少有报道。北京联合大学特殊教育学院鲍平秋团队采用四倍体藤本月季‘多特蒙德’作为母 本 ，二倍体‘北京俏’‘北京红’作为父本，进行杂交育种，培育出了三倍体杂交新种‘特娇’、‘特俏’、‘多娇’、‘多俏’。三倍体月季，一方面可以使结实率降低;另一方面，可以获得更好的观赏效果，同时降低水肥消耗、节约养护管理成本，提高经济效益。南京农业大学王康的专业硕士论文是对古老月季‘月月粉’的四倍体诱导、鉴定和特性研究。

1 确定三倍体育种目标

三倍体月季，一方面可以使结实率降低;另一方面，可以获得更好的观赏效果，同时降低水肥消耗、节约养护管理成本，提高经济效益。培育三倍体月季，要按照园林植物育种目标多样性、高效性、季节性、兼用性等特点，遵循育种目标的预见性、可操作性、可检验性等特点，来选择适合的父母本，已达到预订的育种目标。

2 根据育种目标，确定父本与母本

2.1 母本的选择

选择母本需要考虑到它的开花生物学特性，包括天然授粉结实率、自花授粉结实率、孤雌生殖结实率、天然授粉果实平均结子率及种子萌发率，选择结实率高，种子萌发率高，优点突出的二倍体或四倍体月季品种作为母本。

2.2 父本的选择

在选择父本时，除要求花粉量大、花粉萌发率高外，还要兼顾性状遗传规律。根据育种目标和现有材料，我们选择适合的二倍体或者四倍体月季品种作为父本。

2.2.1 父本花粉生活力测定

花粉采集：摘取选定的父本植株上含苞待放、花瓣抱合的花蕾，在阴凉干燥的室内，用镊子分别取出的花蕾中的花药，将花药放置在硫酸纸上，自然干燥，待花药开裂散粉后收集花粉，进行花粉生活力的测定。

用解剖针在载玻片上撒少量花粉，滴1滴I-IK溶液，盖上盖玻片，用吸水纸将多余药液吸干，将载波片放在显微镜下观察花粉染色情况。每种花粉观察3个视野，分别统计花粉染色情况，从而得出各种花粉生活力状况。

2.2.2 父本花粉发芽率测定

（1）父本花粉发芽率测定方法：在500ml容量的烧杯中倒入100ml蒸馏水，放在微波炉中加热煮开，加入0.4g琼脂和10mg蔗糖，搅拌均匀后，继续加热煮开，加入0.01g硼酸，用玻璃棒搅拌均匀。

（2）制片：用玻璃棒蘸少许培养基，趁热滴入凹形载玻片的凹槽内，等培养基冷却后，用解剖针均匀撒上少量花粉粒。

（3）培养：在培养皿下面垫一层滤纸，向滤纸上滴水直至滤纸吸足水，以保持湿度，将制好的载玻片放入培养皿内，盖好培养皿，放在25℃的恒温箱内进行培养。

（4）镜检：花粉培养一段时间后，取出载玻片，放在显微镜下观察花粉萌发情况。每种花粉观察4个视野，以花粉管长度等于或大于花粉直徑长度为准，分别记录每个视野花粉的萌发数，计算花粉的发芽率。

3 月季三倍体杂交育种的技术

3.1 杂交亲本选择

亲本应具有我们所需要的优良性状和特性，优点多缺点少，而且亲本的优缺点要能互相弥补。亲本来源在地理上应较远，生态类型不同，这样可以丰富杂种遗传性，增强杂种优势。

3.2 母株和花朵的选择

根据育种目标的要求，选择生长健壮、发育良好的作为母株。去雄的花朵以选择植株中上部和向阳的花为好。每枝保留的花朵数一般以3～5朵为宜，多余的去掉，以保证杂种种子的营养。

3.3 去雄

去雄时间都应在雌雄蕊未成熟时，可先用手轻轻剥开花蕾，用镊子剔去花中的雄蕊，仔细检查每片花瓣的基部，以免留有零星散生的雄蕊。小心操作，千万不要损伤雌蕊。

3.4 套袋

为避免计划外植物花粉干扰，去雄后立即套上袋子。袋子两端开口，顶端向下卷折，用回形针夹住，下端应缚在老枝上，因为当年生枝脆易断。套袋后挂上纸牌，用铅笔写明去雄日期。

3.5 授粉

待柱頭分泌黏液发亮时即可授粉。为确保授粉成功，最好连续授粉2～3次。授粉工具一般用毛笔、棉花球;特别少的花粉，用圆锥形橡皮头授粉。授粉后应立即封好套袋，并在纸牌上注明杂交组合、杂交日期、授粉数等。

3.6 杂交后的管理

杂交后，要细心管理，创造良好的、有利于杂交种子发育的条件，并注意观察记载，及时防治病虫害，防止人为的破坏。

4 杂交后代播种、选育

4.1 播种

杂交果实后，逐个剖开，将种子装入透气的牛皮纸袋中。再将牛皮纸袋沙藏在用灭菌灵药液浸泡消毒过的泥瓦盆中沙藏，沙藏用的沙子是新的细河沙。装好盆后，将瓦盆放在建筑物的北墙根，用草袋覆盖，经常检查，保证沙子的湿度在60%左右。在第二年春季，将种子取出，进行盆播。

4.2 选育

因为杂交幼苗比较弱，一定要倍加呵护，做好水肥管理，以保证杂交后代的成活率。由于月季是异花授粉，F1就出现了分离，所以选择在F1进行。杂种植物至少要经过3～5年的形状观察、比较、分析，最终做出性状鉴定。

5 杂交后代倍性鉴定

5.1 形态鉴定

对杂种苗主要从株形、株高、小叶数、叶色、花期、花色、花瓣数、花径、花型、天然授粉结实率方面进行观察。将杂种苗与父母本比较它们之间的关系。

5.2 气孔观察

分别取父母本与杂种苗的叶片，用解剖针、眼科镊在叶背面剥下一层表皮，将撕下的表皮放在载玻片上，滴一滴清水，盖上盖玻片，放在显微镜下观察气孔情况。观察气孔大小，气孔分布密度，并进行比较。

5.3 流式细胞分析仪测定方法

组培苗的获得：

从父母本和杂交种苗上选取直径0.5～0.8cm的新生枝条，用洗衣粉溶液轻轻洗涤，再用自来水冲洗干净，然后放在滤纸上吸干枝条上的自来水。在超净工作台上将枝条剪成约2cm左右的带芽的茎段，每个茎段要带一个节。用70%的酒精消毒1min，用消毒过的蒸馏水振荡冲洗3遍，再用0.1%的升汞溶液消毒2min，然后用消毒过的蒸馏水冲洗3次，再用70%的酒精消毒1min，用消毒过的蒸馏水振荡冲洗3遍，再用0.1%的升汞溶液消毒2min，然后用消毒过的蒸馏水冲洗5次。消毒后，将茎段放在无菌滤纸上，接种在初代培养基上，3周后等芽长到1cm左右时，将芽切下接种到继代增殖培养基上进行增殖。增殖30～45d后即可以将无根苗切离接种到生根培养基上进行生根培养。

称取100mg试管苗嫩茎及幼叶，在滴有2ml提取缓冲液的培养皿中研碎，260目尼龙网过滤，离心（1000r/min）漂洗3次，获得细胞核悬液。将细胞核悬液离心处理后，去掉上层清液，加入染色缓冲液，暗处常温下染色30min。500目尼龙网过滤，滤液用标准试管收集，染色缓冲液为提取缓冲液内加入3000ml/L的RNA酶A和10ml/L EB（溴化乙锭），通过流式细胞分析仪的激发光源照射可激发经荧光染色的DNA分子促发荧光，测定装置测定荧光强度，与测定装置相连的计算机分析软件即可对荧光强度进行分析，观察细胞核DNA含量明显增加的情况。随着植物倍性水平的增高，细胞核DNA含量明显增加。

5.4 根尖染色体测定

针对三倍体月季的倍性测定，还可以通过根尖染色体制片来进行染色体数量测定，以确定杂交种倍性。

5.4.1 测定材料选取

选择杂交种植株的茎段，利用组织培养技术进行接种培养，直至生根。上午8～9点时，截取生长状态良好的组培苗的根尖，长约2cm。

5.4.2 预处理

将切下的根尖清洗后放入0.002mol/L、8-羟基喹啉溶液中，在室温下浸泡45min，抑制纺锤丝的形成。

5.4.3 固定

将根尖取出后，用蒸馏水清洗三遍，投入到卡诺固定液中，放置到4℃冰箱中固定1h，迅速杀死细胞。

5.4.4 解离

将固定之后的根尖清洗3次，投放到5mol/L HCL中，在室温下浸泡10min，使细胞壁软化，易于压片。

5.4.5 染色

将根尖取出，蒸馏水清洗3次，投入到卡宝品红溶液中2～3h，进行染色。

5.4.6 压片

使用双面刀片切去根尖部分，长度约1mm，放置在载玻片上，滴加清水，将盖玻片一侧接触水滴，轻轻盖上盖玻片，用滤纸吸去多余水分。在载玻片下垫上滤纸，使用镊子轻微敲击盖玻片，使根尖细胞分散开。

5.4.7 镜检

将根尖压片制好后，放在显微镜下观察染色体数，以确定被测杂交种的倍性。

6 结语

月季的育种方法很多，随着时间发展，技术进步，我国自育的月季新品种越来越多，培育新品种月季的方法也越来越多，而通过常规杂交育种，培育三倍体月季的研究不多，但是已经有培育成功的报道，这足以证明这种月季三倍体育种方法可行，而且这种培育三倍体月季的方法也是月季育种中不可或缺的。

参考文献

[1] 陈俊愉，程绪珂.中国花经[M].上海文化出版社，1990.

[2] 张鸿景，王鑫，等.浅谈月季的系统分类[J].河北林业科技，2000（6）：13-14.

[3] 贺蕤，杨希，刘青林.月季育种的国内现状和国际趋势[J].月季应用，2017（12）：35-41.

[4] 鲍平秋，丁艳丽，张雷.月季杂交育种研究[J].中国园林，2009，25（8）：97-99.

[5] 孙宪芝.北林月季杂交育种技术体系初探[D].北京林业大学，2004.

[6] 程金水.园林植物遗传育种学[M].中国林业出版社，2000.

[7] 邹琦.植物生理学实验指导[M].中国农业出版社，2000.

[8] 王桂英，张适斌.种子繁殖月季初报[J].河北林业科技，1994（3）：52.

[9] 崔广荣.月季茎段组织培养研究[J].特产研究，2003（3）：34-37

[10] 吴雅琴，常瑞丰程和禾.流式细胞术进行倍性分析的原理和方法[J].云南农业大学学报，2006，21（4）：407-414.

[11] 李海燕，胡国富，胡宝忠.月季组培快繁技术的研究[J].东北农业大学学报，2004，35（1）：84-88.

[12] 林玉红.月季试管苗繁殖的研究[J].甘肃农业科技，1994（1）：364-37.

[13] 李赟，石荫坪，束怀瑞，等.利用流式细胞光度术鉴定苹果倍性[J].西北植物学报，1998，18（4）：499-504.

[14] 李赟，束怀瑞，石荫坪，等.流式细胞光度术用于草莓倍性鉴定的研究[J].西北农业大学学报1998，26（4）：45-48.

[15] 吴雅琴，常瑞丰，程和禾.流式细胞术进行倍性分析的原理和方法[J].云南农业大学学报，2006，21（4）：407-414.

[16] 鲍平秋，黄丛林，胡鸢雷.园林植物的遗传改良[M].科学技术出版社，2011.

[17] 戴思兰.园林植物育种学[M].中国林业出版社，2006.

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