苗期冷冻法快速鉴定小偃麦衍生系的抗寒性

郭慧娟，常利芳，乔麟轶，2，李 欣，2，张树伟，陈 芳，贾举庆，畅志坚，2，张晓军，2

（1.山西农业大学 农学院/作物遗传与分子改良山西省重点实验室，山西太原 030031；2.山西农业大学 省部共建有机旱作农业国家重点实验室（筹），山西太原 030031）

小麦是(Triticum aestivumL.)是我国三大主要粮食作物之一，也是受低温冻害威胁最严重的作物之一[1]。在华北地区，冬季气温较低，有些小麦品种因抗寒性差导致大量分蘖和主茎死亡，品种无法正常越冬，来年的公顷穗数大幅减少，直接影响产量。尤其是近年来随着全球气候变化，极端寒冷天气频现，寒冬和倒春寒等自然灾害时有发生，严重影响了小麦安全生产。因此，对小麦品种进行抗寒性鉴定，挖掘与利用抗寒种质，培育抗寒品种，对于保证小麦的高产和稳产具有重要意义[2-3]。

快速准确鉴定品种的抗寒性是小麦抗寒育种及其种质改良的前提[4]。目前，北部冬麦区品种抗寒性鉴定完全依靠自然鉴定，受年度间冬季温度变化的影响，鉴定结果年度间差异较大，品种抗寒性鉴定的可靠性受到影响，亟需增加在可控条件下的品种抗寒性鉴定试验并建立相应的鉴定评价标准。而室内抗寒性鉴定主要通过形态学、细胞学、分子生物学及一些生理生化指标进行鉴定，其中，室内低温处理、生理生化指标间接鉴定[5]及田间调查越冬死株死茎率、返青率是目前应用较多的鉴定方法[6]。刘艳阳等[7]通过超氧化物歧化酶和过氧化物酶的活性测定及低温胁迫后细胞膜透性来测定小麦品种的抗寒性。姜丽娜等[8]通过测定小麦拔节期低温胁迫下叶片的生理指标，发现叶片相对导电率、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、游离脯氨酸含量、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性可作为小麦拔节期抗寒性鉴定评价指标。辛艳等[9]在田间自然条件下，通过计算越冬前后枯株、死茎的百分率法评价品种的抗寒性，同时采用田间目测法评定材料的冻害等级。张淑霞等[10]通过室内梯度缓慢降温冷冻法研究小麦品种的抗寒性，并提出了临界温度值的概念，使抗寒性鉴定更符合生产需求。但是，室内低温处理后通过生理生化指标测定小麦抗寒性的技术过程繁琐，测定误差较大，准确性受到限制。而田间越冬返青率调查受环境影响较大，遇到暖冬则无法获得品种抗寒性结果。因此，如何在室内可控条件下准确简便鉴定小麦品种的抗寒性成为当下亟待解决的问题。

赵瑞玲等[11]通过室内梯度降温的方法对幼苗进行一定时间的低温冷冻处理后，通过测定不同温度下植株电导率的变化及幼苗冷冻成活率来鉴定不同小麦品种抗寒性，可以得出较为可靠的鉴定结果，但其鉴定方法过于复杂，不适合大量材料的鉴定。为了探索一种室内快速、准确鉴定小麦苗期抗寒性的方法，本研究采用实验室内低温限时冷冻法，对利用小麦和偃麦草远缘杂交获得的29份小偃麦衍生种质进行了室内苗期冷冻成活率测定，结合田间越冬调查，分析与小麦田间越冬冻害等级的相关性，筛选抗寒性较好的小偃麦衍生系种质资源，以期为小麦抗寒育种及遗传研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验选用29份小偃麦衍生系材料，以品种长6878作为抗寒性对照，SY 95-71为半冬性对照。以上31份材料均由山西省作物遗传与分子改良山西省重点实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 室内苗期冷冻鉴定 苗期鉴定试验于2020年10—12月在山西农业大学农学院小麦染色体工程实验室进行。每份材料选大小均匀饱满的籽粒50粒，用蒸馏水冲洗3次，5%的NaClO消毒15 min后，再用蒸馏水冲洗3~5次，种胚向上摆放于双层滤纸作为基质的培养皿中。每个材料3个重复，加入10 mL的蒸馏水，置于22℃的人工气候培养箱中培养10 d，每隔2 d加入适量的蒸馏水。幼苗生长至2叶1心时，调查每个处理的幼苗数量。

将生长有幼苗的培养皿放入冷藏室内，4℃条件下预冷冻处理24 h。然后放入-18℃冷柜中，处理3 h。冷冻结束后，在4℃条件下解冻24 h，再置于20℃条件下进行恢复培养，期间适时补充无菌水。7 d后调查存活苗数，以叶片转呈鲜绿色者为存活。参考陈超等[5]的方法，计算冷冻成活率和抗寒系数。

1.2.2 田间越冬性调查 2020年9月底，将供试材料播种于山西省晋中市榆次区东阳试验基地，采用随机区组设计，2次重复。每个材料按小区进行播种，小区长2 m、宽0.5 m，小区面积1 m2，行距0.25 m，播种量为30粒/行。2021年3月小麦返青后，参照游光霞等[2]和武银玉等[12]鉴定方法，鉴定材料的越冬冻害严重度。共分6级：1级，叶片无冻害；2级，叶尖受冻害发黄，叶片少量枯萎；3级，植株叶片多枯萎，但无冻死，基部仍有绿色；4级，地面有整片枯叶，近半数植株冻死；5级，叶片全部枯萎，多数植株冻死；6级全部植株全株冻死。

1.2.3 田间农艺性状调查 2021年6月材料成熟后每个材料随机选取10株测定产量相关农艺性状，主要包括株高、分蘖数、穗长、每穗小穗数、穗粒数、千粒质量和总产量。千粒质量为籽粒收获后测定3次，取平均值。穗长、每穗小穗数和穗粒数取每个单株的主穗进行测定，结果取平均值。小区产量为小麦成熟后，收获该小区全部植株测定籽粒产量。

1.3 数据分析

冷冻成活率和抗寒系数利用Excel 2010软件进行计算分析。抗寒系数与产量性状的相关分析采用IBM SPSS V 22.0进行计算。

2 结果与分析

2.1 供试材料冷冻成活率比较

经-18℃冷冻处理3 h后，供试材料的冷冻成活率变幅为0.67%~87.33%，平均值为32.20%，变异系数为92.36%。由表1可知，对照长6878的成活率最高，为87.33%，半冬性对照SY 95-71的成活率仅为16.21%。品系16W16-1、CH15132、CH7034、CH 1677的平均成活率均大于80%，具有较强的抗寒性；CH 1302、CH 1532、CH262和14W29的平均成活率均大于45%，为中度抗寒材料；其余材料成活率低于45%，抗寒性较差，其中，品系CH1357的平均成活率最低，仅为0.67%。

表1 供试材料抗寒系数与农艺性状Tab.1 Cold resistance coefficient and agronomic traits of the tested materials

续表1 供试材料抗寒系数与农艺性状Tab.1（Continued） Cold resistance coefficient and agr onomic tr aits of the tested materials

续表1 供试材料抗寒系数与农艺性状Tab.1（Continued） Cold r esistance coefficient and agr onomic tr aits of the tested mater ials

根据公式计算每个品系的抗寒系数，其结果显示16W16-1、CH15132、CH7034、CH1677抗寒系数均 大 于90%，抗 寒 性 良 好；CH 1302、CH 1532、CH 262均大于60%，有一定的抗寒性；而CH 1364、CH16104、CH1343、CH1361、13W43H、CH15145、CH 1355、CH 1357等10个品系的抗寒系数均小于10%，易受冻害影响。

2.2 供试材料田间越冬冻害程度

供试材料田间越冬冻害分布如图1所示。

2021年小麦返青后调查发现，冻害等级最大为6级，最小为2级，变异系数为31.04%，每个等级材料份数分布见图2。其中对照品种长6878冻害2级，半冬性对照SY 95-71冻害为5级。供试材料中16W16-1、CH 7034的冻害等级与长6878相当，CH1302、CH15132、CH1677、CH1532、CH262和16W23-3的冻害等级为3级，共有54.8%的供试材料冻害等级大于4级；CHL10、13W43H、CH15145、CH 1355、CH 1357、CH 1361、CH 1343和CH 1364等8个品系冻害等级最高，与室内冷冻法鉴定结果基本吻合。进一步的相关分析表明，田间冻害级别与室内冷冻成活率呈极显著负相关（P<0.01），相关系数为-0.906。可见，采用室内冷冻成活率可以有效鉴定供试材料的抗寒性。

2.3 抗寒性与产量性状的相关性分析

从各性状的平均值来看（表1、2），31份测试品种（系）的平均株高为82.17 cm，以对照品种长6878（116.27 cm）最高，CH1343（52.40 cm）最矮；有效分蘖数平均为4.52个，以CH 1355（6.86个）最多，16W16-1（2.66个）最少；穗长平均为8.32 cm，CH 15145（11.77 cm）穗子最长，CH 15132（5.51 cm）最短；每穗小穗数平均为21.62个，CH15145（32.03个）最多，CH 1517（16.58个）最少；穗粒数平均为54.75粒，13W43H（84.73粒）最多，CH7034（31.49粒）最少；千粒质量平均为38.99 g，CH 15145（59.52 g）为最高，CH7034最低（25.76 g）；小区产量平均为166.79 g，CH 1677最高，为457.59 g，而CH1357最低，仅6.19 g。可见，这些品种（系）表型性状差异较大，变异类型丰富多样，有利于对其数据进行统计分析。

通过对小偃麦衍生系抗寒系数与7个产量相关性状的方差分析（表2），可以看出，抗寒系数与有效分蘖数和小区产量均呈极显著相关（P<0.01），表明品种（系）的抗寒性可以显著影响植株的有效分蘖数和小区产量。从图2可以看出，随着抗寒系数的增加，即品种（系）抗寒性的增强，该品种（系）的小区产量呈显著增加的趋势，而有效分蘖数则呈显著减少的趋势。抗寒系数与穗长、千粒质量、每穗小穗数和穗粒数均呈显著相关（P<0.05），表明品种（系）的抗寒性也可以显著影响植株的穗长、千粒质量、每穗小穗数和穗粒数。随着抗寒系数的增加，穗长、千粒质量、每穗小穗数和穗粒数均呈减少的趋势。抗寒系数与株高的差异不显著，表明抗寒性对株高的影响较小。

表2 抗寒系数与产量相关性状的方差分析Tab.2 Variance analysis of cold resistance coefficient and yield related traits

3 结论与讨论

小麦因具有较强的生态适应性而在全世界广泛分布，其抗寒性强弱是影响品种广适性的重要特征之一。低温是限制小麦生长、发育的主要因素之一，在我国从南到北几乎所有的小麦种植区都会受到寒害的威胁[13]。在小麦的不同生育时期，影响其生长发育和产量的主要有冬季冻害、早春冻害和低温冷害[14-16]。不同生长时期的冻害对小麦影响不同，研究表明，拔节、孕穗期低温严重影响小麦产量[17-18]。山西省地处内陆，气候干旱，冬季易受极端低温天气影响，春季易出现倒春寒，抗寒材料的鉴定选育尤为重要[19]。

根据田间越冬率鉴定品种的冻害等级是抗寒性鉴定最直接的方法，但田间鉴定需要多年多点重复试验，耗时长，工作量大，而且很容易受到环境的影响。小麦抗寒性的室内鉴定方法目前多采用冷冻处理后测定生理生化指标，鉴定效率和准确性有一定的限制[20]。冷冻成活率是室内鉴定小麦抗寒性最直观的指标，也是植株抗寒性的直接体现。本研究采用-18℃冷冻3 h作为快速鉴定的条件，是在参考赵瑞玲等[11]研究的基础上，以冷冻成活率来检测植株受到极端低温天气后的恢复能力来衡量品种的抗寒性能。但是小麦材料的抗寒性受生态区影响，无法采用统一的衡量标准，这为室内鉴定的准确性带来了一定的困难。本研究在此基础上增加了本生态区抗寒品种作为对照，并将最终的鉴定结果以对照品种为参照转换为抗寒系数，其结果能够更加直观准确地反映供试材料在所在生态区的田间抗寒能力。

优良抗旱种质资源的筛选评价是小麦抗旱性育种及遗传的基础。偃麦草属（Thinopyrum）植物隶属禾本科小麦族，是多年生草本植物，起源于东欧，天然分布于高加索、中亚等地带。它根系发达，能够深入土层深处，抗寒性极强，能够抵抗-40℃低温，对冻害、寒害具有天然的优势，富含大量的抗寒基因，是小麦遗传改良的优异基因库[21-22]，也是小麦遗传改良中应用最成功的物种之一。本研究鉴定的29份材料来源于普通小麦与八倍体小偃麦的杂交组合，其中八倍体亲本TAI7045、TAI8505、TAI8335和XY 7430都表现出较强的抗寒性[23-25]，但其后代材料的抗寒性出现了较明显的分离，参试的29份材料分别源于4个八倍体小偃麦的10个组合，其中源于XY 7430的有19份，源于TAI8505和TAI8335的分别有4份，源于TAI7045的有2份。抗寒系数大于90%的4份材料中有3份来自XY 7430，1份来自TAI8505。29份材料中源于TAI7045的2份材料抗寒系数均低于20%，源于TAI8335的4份材料冻害等级均为4级以上，抗寒系数均低于50%。源于TAI8505的4份材料中有2份表现出较强的抗寒性，另2份抗寒性较弱。来源于XY 7430的19份材料中也有13份抗寒系数低于50%，这可能是由于材料选育过程中由于未进行抗寒性定位选择而使抗寒基因丢失所致。因此，在品种选育与种质资源筛选时，应将品种的抗寒性作为一个重要的指标进行考察。

本研究通过室内冷冻法快速鉴定了29份小偃麦衍生种质的苗期成活率，筛选出4份抗寒系数大于90%的小偃麦衍生系，分别为16W16-1、CH15132、CH7034、CH 1677，经 过 田 间 越冬率 验证，本研究采用的苗期冷冻成活率与田间冻害级别呈极显著负相关，表明采用室内冷冻法可有效鉴定小麦品种的抗寒性，同时这些品种在小麦产量相关重要性状上均表现优异，可为小麦抗寒育种及遗传研究提供了新的优异种质资源，为挖掘新的抗寒基因奠定了基础，对小麦抗寒育种和抗寒性遗传研究具有重要意义。但在生产实践中应注意，小麦能否安全越冬不仅取决于品种的抗寒性，也受其他因素如水肥管理措施、天气寒冷程度等影响[26]，因此，对小麦抗寒性的评价需综合考查。