基于网络药理学探讨人参三七药对抗动脉粥样硬化的作用机制

侯信铮，范吉林，齐璐瑶，张世亮

(1. 山东中医药大学，山东 济南 250014；2. 山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014)

随着人口老龄化进程的加快，我国冠心病患病率呈逐年上升趋势，据测算，我国现患冠心病人数约有1 000万[1]，每年因心血管疾病死亡者大约占总死亡人数的五分之二[2]，该病的防治已成为我国亟待解决的卫生问题。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病的主要病理改变，AS的确切发生机制尚无定论，目前研究认为是炎症反应介导的内皮损伤、脂质浸润和平滑肌细胞增殖等过程参与的慢性进行性病变[3-4]。中医药在缓解心绞痛症状、改善心力衰竭和心肌梗死的二级预防等方面有一定的临床优势[5]。祖国医学将AS导致的冠心病划归到“胸痹心痛病”的范畴进行论治，其中气虚血瘀证是临床常见的证型，张伯礼等[6]等通过分析1970—2010年间公开发表的文献，发现冠心病患者本虚者以气虚为主，标实者以血瘀为首，气虚血瘀为重要证候要素。王传池等[7]通过分析1980—2020年间冠心病中医流调文献发现血瘀和气虚证型分别以64.2%和57.3%居所有证型前两位。王阶等[8]采用聚类分析和对应相关方法研究1 069例患者得到结论，气虚、血瘀和痰浊是冠心病的核心病机。在治疗方面，任毅等[9]通过数据挖掘发现当代名老中医善用健脾化痰、益气活血治法治疗冠心病，使用频率最高的10味中药中就包括人参。人参三七药对作为益气活血的代表药物，被广泛应用于冠心病的防治中，有研究表明[10-11]，人参、三七中的某些成分具有抗AS的作用，但目前的研究多聚焦于某成分作用于单一靶点的研究。网络药理学研究方法认为药物作用于多个靶点，通过多靶点相互作用产生疗效，这与中医的整体观念、中药复方的多成分、多靶点的特点不谋而合[12]。本研究采用网络药理学的方法，对人参三七药对抗AS的复方有效成分和作用靶点、通路进行预测，为下一步实验研究指出方向。

1 资料与方法

1.1人参三七化合物成分及靶点获取 以“人参”“三七”为关键词，检索中药系统药理学平台(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)，以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug-likeness，DL)≥0.18为条件进行筛选，获得人参三七的化合物成分，并检索CNKI对获得的数据进行验证和补充。利用TCMSP数据库，继续检索得到的化合物，获得对应的靶点，将靶点信息导入Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)，使用UniprotKB功能进行靶点基因标准化处理。

1.2AS疾病相关靶点获取 以“atherosclerosis”为关键词，检索GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)，得到AS疾病相关靶点。在GeneCards数据库中，靶点Score值越高，说明靶点与疾病关系越密切，若靶点过多，根据经验，则仅保留Score值≥中位数的靶点进行研究[13]。

1.3人参三七药对-AS交集靶点筛选 将药物靶点和疾病靶点导入Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)取两者交集，得到交集靶点，并绘制Venn图。

1.4交集靶点蛋白互作网络构建 将人参三七药对与AS交集靶点导入STRING数据库(https://string-db.org/)，物种设置为homo sapiens进行蛋白互作(protein protein interaction,PPI)网络构建，以minimum required interaction score>0.4为条件进行筛选，隐藏无互作关系的靶点，以TSV格式将靶点互作数据导出，导入Cytoscape3.7.2软件，对PPI网络进行分析。

1.5交集靶点富集分析 将人参三七药对与AS交集靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，对交集靶点进行GO(gene ontology， GO)和KEGG pathway(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析，以明确交集靶点参与的生物过程(biological process，BP)、细胞组成(cell composition，CC)、分子功能(molecular function，MF)和通路。保留P<0.05的富集结果，同时以count%(富集靶点占交集靶点的百分比)≥10%为条件保留GO富集结果，使用MATLAB 9.0软件将GO富集结果可视化，构建条形图，利用OmicShare在线平台(https://www.omicshare.com/tools/)将count值排名前20的KEGG富集结果可视化，构建气泡图。

1.6成分-靶点-通路网络构建 将人参三七药对化合物成分与交集靶点对应关系、交集靶点与count值排名前20的KEGG通路对应关系建立Excel，导入Cytoscape3.7.2软件构建人参三七药对成分-交集靶点-KEGG通路网络，使用软件内置Analyze Network工具，对网络进行拓扑分析，获得节点的连接度(Degree)等信息，degree值越大，说明与其他节点的关系越密切，从而筛选出在网络中起重要作用的化合物成分、靶点、以预测人参三七药对抗AS的分子机制。

2 结 果

2.1人参三七药对化合物成分和靶点 经检索和筛选，获得人参包含的化合物22种，三七包含的化合物8种，其中，两者共同包含的化合物有4种，见表1。检索化合物得到人参对应的靶点91个，三七对应的靶点154个，将两者靶点合并并删除重复值后获得靶点169个，将169个靶点导入Uniprot进行标准化处理。

表1 人参三七化合物成分

2.2AS疾病相关靶点 检索共获得与AS相关的疾病靶点4 481个，最终保留Score值≥中位数的靶点2 241个。

2.3人参三七药对-AS交集靶点 将人参三七药对169个靶点与AS2241个靶点导入Venny2.1.0后，共获得交集靶点115个，并绘制Venn图，见图1。

图1 人参三七药对与动脉粥样硬化交集靶点

2.4交集靶点PPI网络构建 以minimum required interaction score>0.4为条件进行筛选，隐藏无互作关系的靶点后，构建PPI网络，网络中共有115个点，1 950条边，平均degree值为33.9。将PPI文件以TSV格式导入Cytoscape3.7.2软件进行优化，见图2，图中点的面积与Degree值大小成正比，由此可得出AKT1、IL6、TNF、VEGFA、TP53、JUN、MAPK8等靶点可能为人参三七药对治疗AS的潜在核心靶点。

图2 人参三七药对与动脉粥样硬化交集靶点PPI网络

2.5富集分析结果 通过DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析，以P<0.05和count%≥10%进行筛选后，共获得生物过程22项，主要与RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控、信号转导、DNA模板转录正调控、凋亡过程调控、炎症反应、细胞的增殖调控等相关；细胞组成15项，涉及细胞核、胞质、质膜、胞外基质等；分子功能14项，主要为蛋白质合成、转录因子活性序列特异性DNA结合、酶结合、蛋白质活性调节等。与AS相关的KEGG通路主要涉及PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路、HIF-1信号通路、NF-κB信号通路、趋化因子信号通路、脂肪细胞因子信号通路、胰岛素抵抗等。GO富集结果使用MATLAB 9.0软件绘制条形图，见图3，利用OmicShare在线平台绘制count值排名前20的KEGG通路，得到图4。

A表示GO BP；B表示GO CC；C表示GO MF图3 人参三七药对与动脉粥样硬化交集靶点GO富集分析

图4 人参三七药对与动脉粥样硬化交集靶点KEGG通路富集分析

2.6人参三七成分-交集靶点-KEGG通路网络图 将人参三七药对化合物成分与交集靶点对应关系、交集靶点与count值排名前20的KEGG通路对应关系建立Excel，导入Cytoscape3.7.2软件绘制网络图，见图5，图中矩形表示化合物，圆形表示交集靶点，六边形表示通路，连线表示存在作用关系，图中节点面积越大，表示与其他节点的连接度越高。从图中可以看出，槲皮苷、山柰酚、β谷甾醇、豆甾醇、富马碱等可能为抗AS的主要成分，主要作用靶点包括AKT1、TNF、PTGS2、NFKBIA、IL6、IL1B等。

图中矩形表示成分；图形表示靶点；六边形表示通路图5 人参三七药对与动脉粥样硬化交集靶点成分-靶点-通路网络图

3 讨 论

本研究采用网络药理学的研究方法，发现人参三七药对中的槲皮苷、山柰酚、β谷甾醇、豆甾醇等可能为抗AS的主要成分，主要作用于AKT1、TNF、PTGS2、NFKBIA、IL6、IL1B等靶点，参与的通路主要包括PI3K-Akt信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路、HIF-1信号通路、NF-κB信号通路、趋化因子信号通路、脂肪细胞因子信号通路、胰岛素抵抗等。

Nataliya等[14]研究发现槲皮苷可对抗AS过程中的炎症反应，降低核转录因子kappaB(NF-κB)转录活性，在槲皮素作用下，IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平降低，IL-10水平呈下降趋势；山奈酚可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路上调miR-26a-5p，减轻氧化型低密度脂蛋白诱导的内皮细胞凋亡，从而发挥抗AS的作用[15]；核受体激动剂LXR已被证明可以减轻和逆转动脉粥样硬化，Lifsey等[16]通过研究发现与T0901317等已知的LXR激动剂不同，豆甾醇通过非LXR途径促进肠道胆固醇分泌，以促进胆固醇清除；PI3K-Akt信号通路参与内皮生长因子(VEGF)介导的调节平滑肌细胞迁移和血管生成的过程，同时参与eNOS磷酸化，促进内源性NO的产生[17]，该通路也参与了机体的糖、脂等代谢过程[18-19]；Toll样受体信号通路可参与免疫和炎症反应的调节，介导冠状动脉粥样硬化的发生和发展[20]；miR-199A-5p/HIF-1α可被小核仁RNA宿主基因12(SNHG12)靶向调节，进而导致平滑肌细胞(VSMCs)表型改变而参与AS形成过程[21]；TNF信号通路、MAPK信号通路、NF-κB信号通路、趋化因子信号通路等炎症通路参与了AS形成的各环节，如致炎物质激活对应配体后，MAPK通路被激活，随后其下游的NF-κB信号通路被激活，进而调节炎症因子的表达[22]。综上所述，人参三七药对主要通过调节动脉粥样硬化进程中的炎症反应环节发挥抗AS的作用，同时也可调节脂质浸润、平滑肌细胞增殖等过程。

本文利用网络药理学的研究方法对人参三七药对抗AS的分子机制进行探讨，但研究仍存在一些不足，如并未考虑各化合物在中药中的含量、中药在实际应用时各化合物间是否发生反应，因此对于结论的可靠性仍需进一步生物实验验证。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。