酪蛋白抗凝血肽的分离纯化及其抗凝血活性测定

刘丽莎，苗艳丽,陈绍红,张刘，卢晓

(1.广东海洋大学化学与环境学院，广东 湛江 524088；2.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088)

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)，又称循环系统疾病，这类疾病居全球死亡率首位，预计到2030年将会有超过2 360万人死于心血管疾病[1-2]。血栓类疾病是典型的心血管疾病，具有高发病率、高死亡率、高致残率及并发症多等特点。抗凝治疗是预防和治疗血栓类疾病的主要手段，目前用于治疗该类疾病的药物有很多，主要有肝素、华法林及阿加曲班等，但这些药物都存在一定的副作用，例如引起血小板减少、出血及骨质疏松等，有待进一步发展与完善。

目前，一些食源性蛋白水解、发酵等产物已被证实具有抗凝血活性，如鱼皮蛋白水解物[3]、豆类蛋白水解物[4]、酪蛋白水解物[5]及贻贝、鱼肉蛋白水解物[6-7]等，部分活性肽结构已经得到解析。进而，从食物源中深入研究开发具有抗凝血功能的肽类具有广泛的前景。同时，食源性生物活性肽凭借其吸收性好[8]、副作用小[9]等优点日益受到研究者的重视，其主要来源为乳类蛋白，蛋清蛋白及水产蛋白等。

本实验以酪蛋白为原料，通过菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶4种酶复合酶解酪蛋白获得具有抗凝血活性的小肽[10]，然后采用超滤法初步分离得到纯度较高的抗凝血肽，并利用凝胶色谱法确定其分子量分布。本研究目的在于，以酪蛋白为原料来制备酪蛋白抗凝血肽，研发能够防治血栓性疾病的食源性生物活性肽类药物或具有保健功能的食品，并为这方面的研究提供一定的实验基础和理论依据。

1 实验材料和仪器

新西兰大白兔，两只，雌雄各半，普通级，质量2.3～2.5 kg,广东省医学动物实验中心，生产证号:SCXX(粤)2017-0035。酪蛋白(上海源叶生物科技有限公司)；胰蛋白酶250 U·mg-1、木瓜蛋白酶800 U·mg-1、菠萝蛋白酶300 U·mg-1、中性蛋白酶100 U·mg-1(上海源叶生物科技有限公司);凝血酶(1 000 U/瓶，上海源叶生物科技有限公司)；纤维蛋白原(牛血纤维蛋白原，美国Biosharp公司)；盐酸(广州化学试剂二厂)；磷酸二氢钾、磷酸二氢钠(广州化学试剂二厂)；其他试剂均为分析纯。

恒温水浴振荡器(沈阳莱克斯仪器制造有限公司)；恒温磁力搅拌水浴锅(常州澳华仪器有限公司)；AE触摸式彩屏电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；3H2ORI智能高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；P4型双光束紫外可见光分光光度计(上海美谱达仪器有限责任公司)；Waters 1525高效液相色谱仪(重庆伟琪仪器有限公司)；pH计；MIcroposep Advance离心浓缩管；10 mL和100 mL移液枪等。

2 实验方法和结果

2.1 酪蛋白酶解液的制备 吴雄等[10]用星点设计-效应面法酶解酪蛋白，得到胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶四酶复合酶解酪蛋白的工艺条件。本研究选取表1中4种最佳方案分别对酪蛋白进行复合酶解和混合酶解。称量4.0 g酪蛋白,料水比为1∶7(m/V)，反应体系pH为7.0；根据文献4种蛋白酶混合酶解温度设置为50 ℃；按照每种酶的最适酶用量，加入适量菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶[10]，在50 ℃水解3 h；水解结束，灭活后冷却至室温，以5 000 r·min-1离心10 min。剩下的3个组合的混合酶解以同样的方法进行试验。

复合酶解步骤为：取一份酪蛋白溶液，加入一定量的菠萝蛋白酶，在pH为7.0、60 ℃条件下水解3 h，取出灭活后冷却至常温；然后加入适量胰蛋白酶，50 ℃水解3 h，灭活后冷却至常温；再加入适量中性蛋白酶，50 ℃水解3 h，灭活后冷却至常温；放入离心机中以5 000 r·min-1离心10 min[10]。其余组合同以上步骤。

2.2 抗凝血活性的测定 酶水解物的活力用 ATU 表示，测定方法为凝血酶滴定改进法[11]。测得4个组合混合酶解和复合酶解的抗凝血活性如表1。

表1 混合酶解和复合酶解抗凝血活性

从数据可知“菠萝蛋白酶+胰蛋白酶+中性蛋白酶+木瓜蛋白酶”组合复合酶解抗凝血活性最高，为100.0 ATU·mL-1，“菠萝蛋白酶+胰蛋白酶+中性蛋白酶”混合酶解抗凝血活性较低，为90.0 ATU·mL-1。选择抗凝血活性最高的四酶“菠萝蛋白酶+胰蛋白酶+中性蛋白酶+木瓜蛋白酶”复合酶解液作为样品Ⅰ进行分离纯化。

2.3 超滤法分离抗凝血肽 样品Ⅰ采用截留分子量为1 kD、3 kD的超滤离心管设置转速为3 000 r·min-1，离心30 min，离心结束轻轻取出溶液，获得4个组分：截留分子量1 kD浓缩液(以下简称1 kD浓缩液)、截留分子量3 kD浓缩液(以下简称3 kD浓缩液)；截留分子量为3 kD滤过液和1 kD滤过液 (滤过液指透过超滤膜留在外管的溶液，浓缩液指留在超滤膜以内的溶液)。测定其抗凝血活性，具体数据如表2。

表2 超滤酶解液的抗凝血活性

样品Ⅰ经过超滤， 1 kD浓缩液和3 kD浓缩液的抗凝血活性分别为75 ATU·mL-1和50 ATU·mL-1；3 kD和1 kD滤过液的抗凝血活性分别为30 ATU·mL-1和15 ATU·mL-1。两种滤过液抗凝血活性较低，故不考虑继续进行纯化；选择1 kD浓缩液和3 kD浓缩液测定其体外溶栓和抗凝血实验；对1 kD浓缩液进行纯化。

2.4 体外溶栓和抗凝血实验

2.4.1 体外抗凝血实验 体外抗凝血实验参考[12]，兔耳后采血，待血液未凝固，取5支试管，编号，一号管加入兔血2.0 mL，二号管-兔血∶4%柠檬酸钠溶液(V∶V)=1∶1，三号管-兔血∶1 kD浓缩液(V∶V)=9∶1，四号管-兔血∶1 kD浓缩液(V∶V)=6∶4，五号管-兔血∶1 kD浓缩液(V∶V)=1∶1。将五只试管放入水浴锅中于37 ℃水浴3 min，观察血液凝固时间。3 kD浓缩液同以上方法进行实验。

1 kD浓缩液一号管兔血1min凝固，二号管48 h后凝固，三号管30 min后凝固;四号管48 h后没有凝固。五号管48 h后没有凝固。实验表明经过截留分子量为1 kD的超滤膜的酪蛋白酶解液具有抗凝血作用。图1(1)～(5)分别为1 kD浓缩液一号管、二号管、三号管、四号管和五号管血液凝固情况。

图1 1 kD浓缩液抗凝血实验结果

3 kD浓缩液一号管兔血1 min凝固，二号管48 h后凝固，三号管30 min后凝固;四号管48 h后没有凝固。五号管48 h后没有凝固。实验表明3 kD浓缩液具有抗凝血作用。图2(1)～(5)分别为3 kD浓缩液一号管、二号管、三号管、四号管和五号管血液凝固情况。

图2 3 kD浓缩液抗凝血实验结果

2.4.2 体外溶栓实验 将兔血倒在培养皿中，取一段棉线浸泡在兔血中，待血液凝固后将棉线剪成3～4 cm小段，一段浸泡在样品溶液中，一段浸泡在生理盐水中，将两份溶液于37 ℃下静置24 h，观察溶液与棉线状态，拍照保存。结果如图3所示。

图3 1 kD、3 kD浓缩液体外溶栓实验

图3中(a)、(d)分别是血栓条开始放进生理盐水中和24 h后中的状态，(b)、(e)分别是血栓条放进1 kD浓缩液和24 h后的状态，(c)、(f)血栓条放进3 kD浓缩液和 24 h后的状态，图3实验结果表明，血栓条在1 kD浓缩液和3 kD浓缩液中24 h后均由红色变成白色，由此得出1 kD、3 kD浓缩液具有体外溶栓作用。

2.5 凝胶渗透色谱(GPC)测定肽分子量分布

2.5.1 GPC研究测定分子量分布研究[13]

2.5.1.1 脱盐 选择1 kD的透析袋。将透析袋剪成大约15 cm的小段，取一个500 mL大烧杯，加入适量2%碳酸氢钠和pH为8.0的1 mmol·L-1乙二胺四乙酸二钠，透析袋放入烧杯中煮沸10 min，取出后用蒸馏水清洗透析袋。

将适量1 kD超滤浓缩液装入透析袋中，取500 mL大烧杯加入蒸馏水，将样品溶液置于冰箱中透析，每隔3 h换水，直至大烧杯中不能检出氯离子。透析后的样品溶液作为样品Ⅱ。

2.5.1.2 色谱条件 色谱柱：TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流动相：乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1(V/V)；检测：UV 220 nm；流速：0.5 mL·min-1；柱温：30 ℃

2.5.1.3 标样配制 称取细胞色素C(MW12400)、杆菌酶(MW1450)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(MW451)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189)标准品用流动相溶解配制成0.2 mg·mL-1左右的标准分子量溶液。

2.5.1.4 样品制备 称取样品Ⅱ100 mg于10 mL容量瓶中，用流动相稀释至刻度，使用0.45 μm微孔过滤膜过滤后供进样。

2.5.2 数据处理 样品Ⅱ溶液在上述色谱条件下分析，用GPC软件处理数据，得到样品Ⅱ中肽的相对分子质量分布和其分布范围，结果见表3。

表3 样品Ⅱ中肽相对分子量分布情况

样品Ⅱ的分子量分布如表3所示，综合图4和表3中的结果，可得出分子量主要集中在500～180、1 000～500、2 000～1 000范围，分子量小于1 000的占76.09%，样品总重均分子量为1 398。

图4 样品Ⅱ分子量谱图

3 结论

本实验选用“菠萝蛋白酶+胰蛋白酶+中性蛋白酶+木瓜蛋白酶”组合复合酶解液进行超滤，截留分子量1 kD浓缩液抗凝血活性最高，为75 ATU·mL-1；截留分子量为3 kD浓缩液抗凝血活性为50 ATU·mL-1。选用3 kD浓缩液、1 kD浓缩液进行体外溶栓和抗凝血实验，实验表明3 kD浓缩液、1 kD浓缩液具有较好的体外溶栓和抗凝血作用。对脱盐的1 kD超滤浓缩液进行分子量分布测定，实验结果表明分子量主要集中在500～180、1 000～500、2 000～1 000范围，分子量小于1 000的占76.09%。后续有关1 kD超滤浓缩液的进一步分离及一级结构研究正在进行中。