DNA三角双锥荧光分子探针的制备及初步生物学评价

段晓燕，都义日，翁兆平，王 涛,2，李剑波,2

1内蒙古医科大学附属医院核医学科，内蒙古 呼和浩特 010050；2内蒙古自治区分子影像学重点实验室，内蒙古呼和浩特010050

分子影像技术的发展离不开两个重要因素，即高亲和性的分子探针和探测分子探针信号的成像设备，纳米技术的发展加快了纳米颗粒在生物医学方面的应用［1-3］。纳米颗粒具有信号强度高、载带能力大、尺寸小和多功能潜力等特点，越来越多的研究者转向开发新型纳米颗粒。但一些纳米颗粒由于生物相容性差而对活体动物的正常组织或器官产生潜在的毒性，如量子点［4］、非晶硅纳米颗粒［5］、中空介孔硅球［6］等，导致这些纳米颗粒很难向临床转化。故寻找一种生物相容性好，又能构建成纳米颗粒的材料，成为研究人员的当务之急。

DNA作为一种生物体内储存遗传信息的生物大分子而被大家熟知，而近几年作为一种纳米材料又引起广泛关注［7-8］。DNA能够按照Watson-Crick碱基配对原则构建出各种不同形状和尺寸的DNA纳米结构，如DNA四面体［9-10］、DNA三角双锥［11-12］、DNA立方体［13-14］等。这些结构均表现出结构可控性和高精度性，同时具有稳定性强、生物相容性好和载药能力强等特点［15］。基于DNA纳米结构的优势，本研究将对DNA纳米结构之一的DNA三角双锥结构（DBN）进行荧光标记。因相关文献报道少，本研究计划采用课题组前期放射性核素锝-99m标记DBN的策略来研究荧光试剂DyLight 755标记DBN，并对所制备的荧光分子探针进行一系列的生物学评价，探索分子探针在实验动物体内的生物分布和代谢途径，期望制备的荧光分子探针能够在分子影像和药物载带方面有更广泛的应用。

1 材料与方法

DNA寡聚核苷酸单链（生工生物工程（上海）股份有限公司），GelRed凝胶DNA染色溶液（Biotium），Tris碱（纯度≥99.9%）（上海阿拉丁公司）。裸鼠（雌性，18～20 g）（斯贝福（北京）生物技术有限公司）。除了在实验技术中具体说明以外，其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司（上海）。

实验动物的活体荧光成像及离体组织的荧光成像利用小动物活体影像系统（Berthold LB983 NightOWL）进行。

1.1 DNA三角双锥颗粒的制备

根据既往文献［16］，采用一步退火法制备DBN（图1）。将6条DNA寡聚核苷酸单链（a或T20-a*、b、c、A、B 和C）等摩尔量混匀，加入TM缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L MgCl2，pH 8.0）中，加热至95 ℃维持10 min，然后冷却至4 ℃静置20 min以制备目标产物。

图1 方案一：DBN及荧光分子探针Dylight755-DBN的制备Fig.1 Option 1:Preparation of DBN and fluorescent molecular probe Dylight755-DBN

通过将不同的DNA寡聚核苷酸单链（表1）混合，采用加热退火自组装法来制备携带或不携带侧臂链的DBN。

表1 DNA寡聚核苷酸单链的序列信息Tab.1 Sequence information of DNA oligonucleotide single strand

1.2 DNA三角双锥颗粒的表征

利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术，对目标产物携带侧臂链DBN（T20-DBN）制备过程进行表征。电泳条件：8%PAGE胶，缓冲液为1×TAE缓冲液（12.5 mmol/L MgAc2），在4 ℃条件下电泳1.5～2 h；利用GelRed DNA凝胶染色溶液染色15 min；利用化学发光凝胶成像系统进行成像。

1.3 荧光分子探针的制备

将T20-DBN（由T20-a*、b、c、A、B 和C制备）与等摩尔量DyLight 755-ssDNA（A20）室温下混合，涡旋溶液使其混合均匀，可制得荧光分子探针DyLight 755-DBN，通过紫外分光光度计（HITACHI U-3010，Hitachi，Ltd，Tokyo，Japan）测定浓度。

1.4 体内分布实验

将200 μL DyLight 755-DBN（0.5 μmol/L）通过实验鼠（n=3）尾静脉注射体内，分别于5、15、30、60和120 min处死实验鼠后解剖，取各主要脏器进行称重并通过小动物活体影像系统测定各脏器的荧光计数，计算每克组织中的荧光计数。

本研究中的动物研究方案已获内蒙古医科大学医学伦理委员会批准。动物实验是按照“实验动物护理和使用指南”（ISBN：0-309-58869-3）中的要求进行的。

1.5 小动物活体成像

将200 μL DyLight 755-DBN（0.5 μmol/L）通过实验鼠尾静脉注射体内，分别于注射后5、10、20、30、45及60 min将实验鼠通过异氟烷麻醉后，仰卧位或者俯卧位置于小动物活体影像系统中进行显像。

2 结果

2.1 DNA三角双锥颗粒的制备与表征

将设计不同序列的DNA寡聚核苷酸单链（表1）混合，采用一步退火法来制备T20-DBN。T20-DBN由设计的6条DNA寡聚核苷酸单链（T20-a*、b、c、A、B 和C，表1）构成。将DNA 寡聚核苷酸单链T20-a*、b、c 或DNA 寡聚核苷酸单链A、B、C 这两组组合以及组成T20-DBN的6条DNA寡聚核苷酸单链（T20-a*、b、c、A、B、C）分别混合后进行一步退火实验，将所得DNA样品进行PAGE电泳。结果显示，T20-a*bc和ABC所形成的DNA结构相似，所以在凝胶甬道中的位置相近；而T20-DBN结构相比3条DNA寡聚核苷酸单链制备的DNA结构体积变大，故其在凝胶甬道中的移动速度就会减慢（图2）。

图2 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术表征T20-DBNFig.2 Characterization of T20-DBN by Polyacrylamide Gel Electrophoresis

2.2 荧光分子探针的制备

将近红外荧光试剂Dylight-755偶联到DNA寡聚核苷酸单链A20的5’端（表1），构建T20-DBN侧臂链的互补链DyLight 755-ssDNA（A20）。室温下将T20-DBN与DyLight 755-ssDNA（A20）等摩尔量混合，即可制得荧光分子探针DyLight 755-DBN，通过紫外分光光度计定量浓度至1 μmol/L用于后续实验研究。

2.3 体内分布

将DyLight 755-DBN注射进入实验鼠体内后，于5、15、30、60和120 min将实验鼠处死取主要脏器，称重并通过小动物活体影像系统测定各脏器的荧光计数，计算每克组织中的荧光计数。体内分布结果显示，DyLight 755-DBN进入体内后，荧光信号主要集中在肾脏、肝脏、脾脏、胃；注射荧光探针5～15 min，在实验鼠的肺有一定的荧光信号，但15 min后，荧光信号几乎没有；在进行体内分布研究的各个时间点，在心脏和脑部没有探测到荧光信号（图3）。

图3 DyLight 755-DBN在实验鼠体内的分布情况Fig.3 Distribution of DyLight 755-DBN in experimental mice(n=3)

2.4 小动物活体成像

将DyLight 755-DBN通过实验鼠尾静脉注射入体内，于注射后的各个时间点将实验鼠麻醉后俯卧位或仰卧位置于小动物活体影像系统中进行显像。

通过实验鼠仰卧位的显像结果（图4，下排）显示，DyLight 755-DBN进入实验鼠体内后分布迅速，注射5 min后，在实验鼠的肝脏处出现荧光信号，注射30 min后，肝脏中的荧光信号一直比较强，直到注射45 min后，肝脏中的荧光信号开始下降；注射10 min后，膀胱处出现荧光信号，直到60 min，膀胱中维持较强的荧光信号。通过实验鼠俯卧位的显像结果（图4，上排）显示，注射DyLight 755-DBN 5 min后，在实验鼠的胃部出现荧光信号，直到60 min，胃部一直维持较强的荧光信号。

图4 DyLight 755-DBN注射后不同时间点的实验鼠活体显像图Fig.4 In vivo imaging of experimental mice at different time points after injection of DyLight 755-DBN

3 讨论

本研究选择DNADBN作为研究对象，其不但具有DNA纳米结构的优势和特点，并且制备简单，通过将6条DNA寡聚核苷酸单链混匀，采用加热退火自组装方法来制备目标产物DBN。在课题组前期的研究中，为了实现DBN的放射性核素标记，我们将组成DBN的一条寡聚核苷酸单链5’端偶联寡聚核苷酸单链T20，制备带有侧臂链的T20-DBN；同时利用氯化亚锡还原标记法，将锝-99m 标记寡聚核苷酸单链A20，得到99mTc-A20；利用DNA的Watson-Crick碱基配对原则，其中A与T相互配对，将T20-DBN与99mTc-A20混合杂交成功制备分子探针99mTc-DBN。基于放射性核素标记DBN的制备策略，本研究中将采用同样的策略制备荧光分子探针。首先，从组成DNA三角双锥纳米结构的6条寡聚核苷酸单链中选取一条（a），将其5’端偶联寡聚核苷酸单链T20，将各条寡聚核苷酸单链T20-a*、b、c、A、B和C混匀采用一步退火法制备T20-DBN；将荧光试剂DyLight 755偶联于寡聚核苷酸单链A20的5’端，得到Dylight755-A20；将二者等摩尔量混匀，即可成功制备荧光分子探针DyLight 755-DBN。

通过将荧光分子探针DyLight 755-DBN注射入实验鼠体内后，进行分子探针的系列体内研究。通过体内分布和小动物活体显像研究显示，DyLight 755-DBN在实验鼠体内，主要分布于肝脏、肾脏、胃和脾脏，通过膀胱进行排泄。课题组前期的研究中制备的放射性分子影像探针99mTc-DBN，体内分布和小动物SPECT/CT显像结果显示，肝脏、肾脏和脾脏有明显的放射性摄取，在注射分子探针15 min后，在肠道也有一定的放射性摄取，最后也是通过膀胱进行排泄［16］。两种单模态的分子影像探针的体内研究显示出相似的结果。两种单模态显像技术具有各自的优势，而DNA纳米结构的优势之一就是易于化学修饰与药物载带。故在后期的研究中，我们期望构建一类基于DNA纳米结构的双模态分子探针，同时具备近红外荧光成像和核医学成像（正电子发射型计算机断层显像或单光子发射计算机断层扫描）两种显像模式的优势，能够为药物的体内代谢或药物治疗的机制研究提供更多信息。

综上所述，本研究采用一步退火法制备DBN，并采用侧臂链杂交策略成功制备荧光分子探针DyLight 755-DBN。通过系列生物学评价实验，证明荧光分子探针DyLight 755-DBN是一种性质优良的分子影像探针。