HPLC测定藿香正气制剂中2种抗病毒类成分的含量

胡冬青,王 伟(山东中医药大学附属医院中医科,济南 250011;通讯作者,E-mail:sminling365@163.com)

藿香正气制剂出自宋代《太平惠民和剂局方》,由藿香、厚朴、白芷、陈皮、苍术等10味中药组成,具有解表化湿、理气和中等功效,常用于外感风寒、内伤湿滞或夏伤暑湿所致的感冒,临床上用于头痛昏重、胸膈痞闷、脘腹胀痛、呕吐泄泻等症状的治疗[1,2]。随着现代中药制剂的发展,为满足易服、便携的用药需求,已开发制成多种制剂,如藿香正气口服液、藿香正气散、藿香正气片、藿香正气水、藿香正气丸等[3]。

2019年12月以来,新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的急性肺炎(COVID-19)在全世界蔓延,夺走了数百万人的生命,被列为“国际关注的突发公共卫生事件”[4],给全世界带来了严重的危害,迫切需要寻找一种快速、有效的治疗方法。我国救治新冠肺炎的成功经验表明,中医药能够在预防、治疗、康复等方面发挥有效作用[5]。据报道,藿香正气胶囊(丸、水、口服液)等制剂对COVID-19具有解表化湿、理气和中作用,可有效缓解乏力、胃肠不适等症状,是《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第五版)》中推荐的医学观察期乏力伴胃肠不适者的预防用药[6]。研究表明,藿香正气制剂中含有黄酮、香豆素、挥发油、生物碱等多类成分,其中芹菜素、槲皮素等黄酮类成分具有显著的抗病毒作用[7-10]。同时,邓燕君等[11]通过网络药理学与分子对接法对藿香正气口服液预防新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的活性化合物进行了研究,结果显示,抗病毒综合评分最高的5个化合物分别是槲皮素、异鼠李素、葛花苷元、山柰酚、汉黄芩素。纪敬敏等[12]采用网络药理学技术探讨了藿香正气液干预新型冠状病毒感染的潜在靶点,结果显示,决明色酮、芹菜素、鼠李素、槲皮素等化合物具有较强的抗病毒靶标。目前,藿香正气制剂的质量控制主要以厚朴酚、和厚朴酚及橙皮苷为指标成分进行含量测定,未建立黄酮类成分HPLC含量测定方法,建议在藿香正气制剂研究生产和质量控制过程中,对槲皮素、芹菜素、异鼠李素等化学成分进行重点关注和控制。因此,本课题组以槲皮素和芹菜素2种黄酮类成分为指标成分,建立了同时测定藿香正气系列制剂中槲皮素和芹菜素2种黄酮类成分含量的HPLC方法,为藿香正气制剂质量标准的提升奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters2695高效液相色谱仪:包括PDA检测器,Empower工作站(美国Waters公司);CPA225D型十万分之一电子天平(德国赛多利斯集团);KQ-500DE型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

对照品:槲皮素(批号100081-200406)购自中国食品药品检定研究院,芹菜素(批号AF9032008)购自成都埃法生物科技有限公司;藿香正气胶囊(同药集团,批号分别为20030035,20030012),藿香正气软胶囊(神威药业,批号分别为200706,200918),藿香正气合剂(太子药业有限公司,批号分别为200612,200714)、藿香正气水(云南白药集团,批号分别为S0055,S0042)、藿香正气滴丸(天士力控股集团,批号分别为200316,200518)、藿香正气丸(上海宝龙安庆药业,批号分别为20200504,20200615)购自济南市爱心大药房甲醇为HPLC级(德国Merck公司);醋酸为分析纯(美国TEDIA公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

以Luna®-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)为色谱柱;以甲醇-0.4%磷酸溶液为流动相梯度洗脱:0～15 min,40%～45%A;15～20 min,45%～52%A;20～40 min,52%～55%A;流速1.0 ml/min,检测波长为360 nm;进样量10 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取槲皮素对照品12.86 mg、芹菜素对照品10.22 mg,精密称定,置于100 ml的量瓶中,加甲醇溶解至刻度,制成质量浓度为128.6 μg/ml和102.2 μg/ml的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 藿香正气胶囊:取10粒本品,去外壳,研细混合,精密称取1.0 g置于10 ml容量瓶中,加70%甲醇至刻度,超声30 min,放冷过滤,续滤液作为供试品溶液;藿香正气丸:取10粒本品,研细后混匀,将内容物混匀后精密称取1.0 g置于10 ml量瓶中,加70%甲醇至刻度,超声30 min,放冷过滤,续滤液作为供试品溶液;藿香正气滴丸:取1袋本品,研细后混匀,精密称取1.0 g置于10 ml量瓶中,加70%甲醇至刻度,超声30 min,放冷过滤,续滤液作为供试品溶液;藿香正气水:精密移取本品1.0 ml,置于10 ml量瓶中,加70%甲醇至刻度,超声提取30 min,放冷过滤,续滤液作为供试品溶液;藿香正气软胶囊:取10粒本品,去除胶囊壳,混匀内容物,精密称取1.0 g置于10 ml量瓶中,加70%甲醇超声30 min,放冷,过滤,续滤液作为供试品溶液;藿香正气合剂:精密移取本品1.0 ml,置于10 ml量瓶中,加70%甲醇至刻度,超声提取30 min,放冷过滤,续滤液作为供试品溶液。

2.3 系统适用性试验

精密量取上述对照品溶液、不同剂型供试品溶液、阴性溶液,按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱,见图1。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.2.1”项下对照品0.05,0.1,0.5,1.0,5.0,10 ml至10 ml容量瓶中,加70%甲醇定容至刻度。分别精密吸取10 μl注入HPLC分析,以峰面积Y对进样浓度X进行回归方程计算,得槲皮素、芹菜素在0.643～128.6 μg/ml,0.511～102.2 μg/ml范围内与峰面积的回归方程分别为Y=47 491X-3 145.5(r=0.999 9)和Y=40 312X+8 950.2(r=0.999 7)。

2.5 精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下标准品溶液连续进样6次,测得槲皮素、芹菜素的峰面积RSD分别为0.94%和1.02%(见表1)。表明仪器精密度良好。

1.槲皮素;2.芹菜素图1 混合对照品与藿香正气不同制剂的高效液相色谱图Figure 1 HPLC of mixed reference substance and Huoxiang Zhengqi preparations

2.6 重复性试验

取同一批次(批号20030035)的藿香正气胶囊,按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液,平行6份,进样分析,测得槲皮素、芹菜素的峰面积RSD分别为1.02%和1.33%(见表1)。表明方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取同一批次(批号20030035)的藿香正气胶囊供试品溶液,分别在0,2,4,6,8,12,24 h进样分析,测得不同藿香正气制剂槲皮素、芹菜素的峰面积RSD(见表2),结果表明样品24 h内稳定。

表1 精密度和重复性试验结果

表2 稳定性试验结果

2.8 加样回收试验

取已知含量的(批号20030035)藿香正气胶囊样品6份,每份约1.0 g,按约1 ∶1的比例加入槲皮素、芹菜素对照品,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,进样分析,计算回收率,结果见表3。

表3 加样回收率试验测定结果 (n=6)

2.9 样品含量测定

取不同藿香正气制剂,平行3份,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件分析,以外标法计算含量,结果见表4。

表4 不同制剂含量测定结果 (n=3)

3 讨论

3.1 流动相的选择

黄酮类成分带有酚羟基,显一定的弱酸性。在流动相系统的考察中,参照文献并选择了甲醇-0.4%磷酸溶液、甲醇-0.4%醋酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液、乙腈-0.4%醋酸溶液4种流动相系统。结果显示,以甲醇-0.4%磷酸溶液为流动相时,2种被测成分的分离度、峰形最佳,基线平稳。

3.2 制备方法的选择

分别对提取溶剂(甲醇、乙醇),提取溶剂浓度(50%,70%,100%)和超声提取时间(15,30,45,60 min)进行了考察。结果显示,以70%甲醇、超声提取30 min为提取最佳条件。

3.3 指标成分的选择

网络药理学技术对藿香正气口服液预防新型冠状病毒肺炎的活性化合物研究结果显示,藿香正气制剂中黄酮类成分芹菜素、槲皮素具有显著的抗病毒作用,抗病毒综合评分最高,与洛匹那韦和瑞德西韦有相近的结合能,因此,选择芹菜素和槲皮素作为测定指标成分。

综上所述,为进一步完善藿香正气制剂质量标准,提升藿香正气制剂质量控制水平,本试验建立了藿香正气制剂中槲皮素和芹菜素2种成分的HPLC含量同时测定方法。实验结果显示,与2020版《中国药典》中主要以厚朴酚、和厚朴酚及橙皮苷等成分为指标成分的质量标准方法相比较,本研究所建立的方法增加了质量控制成分类别,提高了产品的质量控制水平,且方法专属性强、重复性好、稳定简便、回收率高,可以用于藿香正气制剂产品的质量控制。