枯草芽胞杆菌甘露聚糖酶发酵条件优化

李盛前， 侯 颖， 范鑫诺， 陈阳阳， 宫 强， 李 阳， 徐建强

(1.河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023；2.河南省食品微生物工程技术研究中心，河南 洛阳 471023；3.微生物资源开发与利用河南科技大学重点实验室，河南 洛阳 471023；4.河南科技大学 园艺与植物保护学院，河南 洛阳 471023)

β-甘露聚糖酶(β-mannanase)属于半纤维素酶类，是一类可以随机水解含有β-1,4-D-甘露糖主链的葡甘露聚糖、甘露聚糖、半乳甘露聚糖等多糖， 并释放这些糖类中的甘露糖或功能性低聚糖的酶[1]。β-甘露聚糖酶在食品加工和动物饲料中应用广泛。在食品中添加β-甘露聚糖酶能调节肠道菌群环境，增强有益菌抑制有害菌的生长和代谢，促进双歧杆菌的生长[2]。将β-甘露聚糖酶加入到果汁中可降低其黏度，改善其澄清度[3]；在速溶咖啡生产过程中加入β-甘露聚糖酶，可提高速溶咖啡可溶性固体的产量[4]。β-甘露聚糖酶可分解植物细胞壁，释放细胞壁内的营养物质，降低动物肠道内食靡的黏度，促进十二指肠吸收表面积和空肠绒毛高度的增加，提高肠道对营养物质的吸收率和饲料利用率[5-6]。此外，β-甘露聚糖酶还有助于提高仔猪机体的抗氧化能力[7]和肉鸡的生长性能与免疫力[8-9]。β-甘露聚糖酶广泛存在于植物、动物、微生物中，而微生物来源的β-甘露聚糖酶种类丰富，是β-甘露聚糖酶的最主要来源，从微生物中提取β-甘露聚糖酶具有易获得、高活性、低成本的特点，因此，国内外学者对微生物来源的β-甘露聚糖酶研究最为广泛[10]。其中，研究较多的是芽胞杆菌和曲霉等微生物来源的β-甘露聚糖酶。在不同种类的芽胞杆菌中，枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)能够生产出高活性β-甘露聚糖酶[11]。国内外学者对微生物生产β-甘露聚糖酶发酵条件的优化也进行了较多研究，Norizan 等[12]利用枯草芽胞杆菌ATCC11774为生产菌株，半固态发酵生产β-甘露聚糖酶，通过对产酶发酵培养基成分进行优化，优化后的棕榈仁饼(Palm kernel cake)发酵培养基产酶量比营养肉汤高4倍。Ozturk 等[13]利用响应面法的Box-Behnken设计对重组大豆曲霉ATCC11906 (AsT1)摇瓶发酵生产β-甘露聚糖酶的最大条件进行了优化，优化后培养基产酶量是在葡萄糖培养基上发酵产酶的1.4倍。微生物资源开发与利用校级重点实验室微生物基因工程课题组在前期研究中分离筛选到一株产β-甘露聚糖酶的枯草芽胞杆菌BacillussubtilisJ，所产甘露聚糖酶最适反应温度为60 ℃，在70 ℃仍有一定的酶活力和稳定性，为进一步提高该酶在工业生产中的潜力，本研究通过单因素和响应面试验对产酶发酵培养基成分和发酵条件进行探索，以提高产酶量为目的，同时为高温β-甘露聚糖酶的酶学性质和应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 菌株BacillussubtilisJ由河南科技大学食品与生物工程学院基因工程实验室分离并保存。

1.1.2 主要试剂与仪器设备 魔芋粉(河南悦欣生物科技有限公司)；刺槐豆胶(郑州卓研生物科技有限公司)；瓜儿豆胶(河南万邦实业有限公司)；3,5-二硝基水杨酸(上海强顺化学试剂有限公司)；四水酒石酸钾钠、苯酚和无水亚硫酸钠(天津市德恩化学试剂有限公司)；其他试剂均为国产分析纯或国产生化试剂。可见光分光光度计(722N，上海悦丰仪器仪表有限公司)；高速冷冻离心机(H1850R，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；恒温培养箱(DH-500，北京中兴伟业仪器有限公司)；双人单面净化工作台(SW-CJ-2D，苏州净化设备有限公司)。

1.1.3 培养基 ①LB培养基；②基础发酵培养基(g/L)：魔芋粉10，胰蛋白胨5，K2HPO46，MgSO4·7H2O 1，pH自然，115 ℃高压灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化 于-80 ℃冰箱中取出冷冻保藏的菌株BacillussubtilisJ，划线于LB固体培养基，37 ℃培养24 h，然后转接LB液体培养基中，37 ℃，180 r/min培养12 h。

1.2.2 菌株发酵与粗酶液制备 以2%(体积分数，下同)接种量，将培养12 h的菌液，接入装有基础发酵培养基的锥形瓶(50 mL/250 mL)中，37 ℃、180 r/min发酵24 h后，4 ℃，8 000 r/min冷冻离心10 min去除菌体和杂质，上清液即为粗酶液，用其测定β-甘露聚糖酶活力。

1.2.3 酶活力测定 采用DNS法[14]测酶活力，酶活力定义为以5 g/L槐豆胶为底物，60 ℃水浴反应10 min，每1 min产生相当于1 μmol D-甘露糖的还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位U。

式中：a为由标准曲线查得甘露糖微克数(μg)；b为稀释倍数；180为甘露糖分子量；0.1为酶液毫升数(mL)；t为反应时间(min)。

1.2.4 单因素试验 按1.2.2发酵条件，研究基础发酵培养基碳源10 g/L(魔芋粉、刺槐豆胶、蔗糖、D-甘露糖、可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖、D-木糖和瓜尔豆胶)，碳源质量浓度(10、15、20、25、30、35、40、45、50 g/L)、氮源5 g/L(蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、尿素、硫酸铵、硝酸钾、酪蛋白、胰蛋白胨和大豆蛋白胨)、氮源质量浓度(5、10、15、20、25、30、35、40、45 g/L)、温度(25、30、35、40、45 ℃)、初始pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、接种量(0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%)、装液量(25、50、75、100、125、150 mL)对菌株产β-甘露聚糖酶的影响。每个水平3个重复，根据酶活力高低确定最佳发酵条件。

1.2.5 响应面试验设计 根据单因素试验结果，采用中心组合试验Box-Behnken设计方案，选择对β-甘露聚糖酶活力影响较大的4个因素(碳源、氮源、初始pH值和温度)。使用Design Expert 8.0.6软件进行响应面设计。每个因素设3个水平(-1、0、1)，每个实验组设置3个平行，以β-甘露聚糖酶活力作为响应值，对发酵条件进行设计优化。响应面试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平设计Table 1 Factors and horizontal design of response surface test

2 结果与分析

2.1 碳源种类及浓度对菌株产β-甘露聚糖酶的影响

选取9种不同物质作为碳源，菌株BacillussubtilisJ在以初始碳源质量浓度为10 g/L，发酵培养24 h后，β-甘露聚糖酶的酶活力如图1A所示，不同碳源对枯草芽胞杆菌产酶影响较大，魔芋粉、刺槐豆胶和瓜尔豆胶为碳源时，β-甘露聚糖酶的酶活力较高，其中菌株利用魔芋粉产酶能力最好，达到了25.12 U/mL，而葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖、麦芽糖和可溶性淀粉为碳源时，枯草芽胞杆菌产β-甘露聚糖酶活力较弱，酶活力仅为5.8～7.3 U/mL，因此确定魔芋粉为最佳碳源。由图1B可知，魔芋粉的质量浓度在10～30 g/L范围内，产酶量随着质量浓度的增加而逐步升高。在碳源质量浓度为30 g/L时，产酶量达到最大值，之后，随着碳源质量浓度的增加，菌株产酶活力开始缓慢下降。因此，确定碳源最佳质量浓度为30 g/L。

图1 碳源种类(A)及浓度(B)对菌株产酶的影响Fig.1 Effects of carbon source types(A) and concentrations(B) on enzyme production by strain图中不同的小写字母分别表示在不同的碳源种类和浓度之间的显著差异性(P<0.05)Different lowercase leters in figure A and figure B indicate significant differences (P<0.05)

2.2 氮源种类及浓度对菌株产β-甘露聚糖酶的影响

由图2A可知，在有机氮源中胰蛋白的产酶效果最好，达到了46.01 U/mL，其次是蛋白胨；在无机氮源中，硝酸钾和硫酸铵也有较好的产酶效果。因此，确定最佳的氮源为胰蛋白胨。由图2B可知，以胰蛋白胨为最佳氮源时，在5～20 g/L的范围内，随着胰蛋白胨浓度的升高，菌株的产酶能力也逐渐上升，在20 g/L时菌株的产酶效果最好，之后菌株产酶能力随着胰蛋白胨浓度的升高而逐步降低。因此，确定最佳的氮源浓度为20 g/L。

图2 氮源种类(A)及浓度(B)对菌株产酶的影响Fig.2 Effects of nitrogen source types (A) and concentrations (B) on enzyme production by strain图中不同的小写字母分别表示在不同氮源种类和浓度之间的显著差异性(P<0.05)Differene lowercase letters in figure 2A and figure 2B indicate significant diferences (P<0.05)

2.3 发酵条件对菌株产β-甘露聚糖酶的影响

如图3A所示，当发酵温度达到30 ℃时，酶活力达到最大值45.72 U/mL，但当温度进一步升高时，酶活力急剧下降。因此，确定最适发酵温度为30 ℃。由图3B可知，初始pH值在7～8之间有利于菌体产酶，且在4～8之间随着pH的升高，产酶量逐步增加，最高酶活力可达到57.62 U/mL，而当pH值大于8，产酶量随着pH的升高而降低。由图3C可知，当装液量为50 mL/250 mL时，酶活力达到最大值65.98 U/mL，当装液量太少(小于50 mL)时，发酵液会在锥形瓶的内壁上形成一层薄膜，影响菌体的生长繁殖，从而导致产酶量有所下降，因此，最佳装液量为50 mL/250 mL。由图3D可知，当接种量达到1%(体积分数)时，酶活力达到最大值78.60 U/mL。随着接种量的增加，产酶量开始缓慢下降，当接种量达到7%后，产酶量开始大幅度下降。这是因为随着接种量的增加，大量的菌体会消耗有限的营养物质，营养物质消耗过快，有毒物质大量积累，致使菌体产酶能力下降。因此，确定最佳接种量为1%。

图3 发酵条件对菌株产酶的影响Fig.3 Effect of fermentation conditions on enzyme production by strains

2.4 响应面结果与分析

通过使用Design Expert 8.0.6软件对表2数据进行多元回归拟合分析，得到以β-甘露聚糖酶酶活力为响应值的回归方程：

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface test

R=83.05-5.10A+1.20B-0.49C+5.96D-1.57AB-5.83AC+2.24AD+6.03BC+3.11BD+5.37CD-8.15A2-4.37B2-5.72C2-13.93D2

其中，R表示β-甘露聚糖酶活力的预测值(U/mL)，A、B、C和D分别代表魔芋粉(g/L)、胰蛋白胨(g/L)、温度(℃)和pH。

响应面可直接反应各因素间的交互作用，所形成响应面的坡度越陡，其影响越显著，坡度越平缓，影响越小[15]。如果密集形成的等高线是椭圆形或鞍形，则表明2个因素的交互作用的影响越大；密集形成的等高线是圆形，则表明两个因素交互作用的影响越小[16]。对试验结果进行拟合二次模型方差分析如表3，模型的P值(Prob>F)为0.000 1<0.05，说明模型高度显著。此模型的相关系数为92.55%，即预测仅有7.45%的数据不能用该模型解释。该模型的失拟项值(0.069 5)大于0.05，故说明此模型没有失拟现象。回归方程系数显著性检验结果：一次项A、D对酶活力影响极显著；二次项A2、C2、D2对酶活力的影响极显著，而B2对酶活力的影响显著；交互项AC和CD的交互作用均显著，BC交互作用极显著，说明魔芋粉和温度、温度和pH的交互作用对枯草芽胞杆菌产酶有显著影响，而胰蛋白胨和温度对枯草芽胞杆菌产酶有极显著影响，AB、AD和BD交互作用不显著。由F值得出，各因素试验对枯草芽胞杆菌产β-甘露聚糖酶活力影响的主次顺序为D>A>B>C，即pH>魔芋粉>胰蛋白胨>温度。

表3 响应面试验结果方差分析Table 3 ANOVA of response surface experimental results

使用Design Expert 8.0.6软件对回归方程中的交互项AB、AC、AD、BC、BD和CD绘制响应面和等高线图如图4所示，各因素之间有不同程度的交互作用，各因素交互作用形成的响应面图均为曲面，且开口方向朝下，这表明随着各个因素的增长，对枯草芽胞杆菌产β-甘露聚糖酶影响变大，当其增大到最大值后，随着各因素继续增大，对枯草芽胞杆菌产β-甘露聚糖酶影响将逐渐减小。

图4 各因素交互作用的影响Fig.4 Influence of interaction of various factors

2.5 验证试验结果

经Design Expert 8.0.6软件分析得到的枯草芽胞杆菌产β-甘露聚糖酶最佳发酵条件为魔芋粉28.23 g/L，胰蛋白胨21.14 g/L，温度31.55 ℃，pH值 8.50，在此条件下菌株产β-甘露聚糖酶酶活力预测值为84.65 U/mL。为了验证预测值的准确性和实际试验操作便利性，将发酵条件调整为魔芋粉28 g/L，胰蛋白胨21 g/L，温度31 ℃，pH值 8.5，在此条件下进行3次验证试验测得β-甘露聚糖酶酶活力平均值为(84.38±0.30) U/mL，与理论值的相对误差较小，说明模型可靠，可作为实际生产的依据。

3 讨 论

本研究经过单因素试验和响应面优化后，确定菌株BacillussubtilisJ发酵生产β-甘露聚糖酶的最佳条件为魔芋粉28 g/L，胰蛋白胨21 g/L，K2HPO46 g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，温度31 ℃，pH值 8.5，接种量1%(体积分数)，装液量50 mL/250 mL，发酵周期24 h，该条件下β-甘露聚糖酶活力达到84.38 U/mL，是基础发酵培养基产酶活力(25.12 U/mL)的3.36倍。

培养基碳氮源种类及浓度优化对菌株产酶的影响。通过单因素试验对发酵培养基碳源种类进行优化后发现，以魔芋粉、瓜尔豆胶、刺槐豆胶为碳源时，菌株产酶活力明显高于其他碳源，分析认为这与β-甘露聚糖酶属于诱导酶直接相关，在对路德维希肠杆菌(Enterobacterludwigii)[17]、类芽胞杆菌(PaenibacillusAsh)WY-01[18]等菌株发酵优化的研究报道中，都有魔芋粉为最优诱导产酶底物的结论，本研究结果与上述结论一致。

发酵条件优化对菌株产酶的影响。龚劲松等[19]利用BacillussubtilisYH12为生产菌株，在初始pH为7.5、培养温度30 ℃和装液量为50 mL/250 mL的条件下，发酵33 h后产酶活力达到280 U/mL，相比初始水平提高约5倍。汤文晶等[20]用科氏芽胞杆菌(Bacilluscohnii)为生产菌株在最适培养温度、pH和装液量为55 ℃、9.5和75 mL/250 mL条件下，发酵生产36 h后，产酶活力达到0.345 U/mL，是优化前产酶活力的4.3倍。本研究发现，在温度为30 ℃、初始pH为8和装液量为50 mL/250 mL时，菌株产β-甘露聚糖酶的酶活力可达到65.98 U/mL，较未优化环境条件前(46.01 U/mL)提高了1.43倍。

从本研究结果来看，虽然优化后菌株BacillussubtilisJ产β-甘露聚糖酶的酶活力比利用路德维希肠杆菌[17]高，但仍然比类芽胞杆菌WY-01[18]和BacillussubtilisYH12[19]的产酶活力低。做为一种不产生毒素，无致病性且具有较好产β-甘露聚糖酶能力的枯草芽胞杆菌，这为工业生产β-甘露聚糖酶提供了良好的菌株资源。为进一步提高β-甘露聚糖酶的产量，后期可以利用物理或化学方法对菌株BacillussubtilisJ进行诱变处理[21]，以及利用基因工程手段将其酶基因导入到合适的菌中，实现β-甘露聚糖酶基因的高效表达。