浅谈基于质谱技术的代谢组学在体外药物肝毒性评价中的研究进展

张阳 阮海文 邵文桂 窦德虎 王静 张雪峰

关键词：质谱技术;代谢组学;体外药物肝毒性;细胞模型

【中图分类号】 O657.63 【文献标识码】 A       【文章编号】2107-2306（2021）02--02

药物毒性（drug hepatotoxicity，本文简称DH）评价在药物研发过程中属于一个关键性的环节，药物毒性反应中，肝脏为其靶器官，常见于外源性物质与相关代谢物中，对肝脏的损伤较大，可至功能障碍与紊乱[1]。从对临床药物试验失败和撤回警告的原因中分析，得知药物诱导性肝损伤的危害最大。有关数据显示，受药物诱导性肝损伤影响，药物早期研发便终止的比例约有14%左右[2]。因此，必须重视DH的评价工作，及早发现具有相关风险的药物，促进药物研发的成功性。

药物暴露对细胞的功能结构均有着一定影响，甚至还会使得细胞代谢时的内源性代谢物失衡，细胞便会响应毒物或其他刺激，加剧毒性反应的发生。从而可知，直接反应药物毒性还可选择细胞代谢表型变化作为评价指标。在代谢组学之下，对生物样品分子的质量进行了有效分析，发现其质量低于1000u时，便可完成毒性损伤情况的反应，对生物标志物和毒性机制的发现均有推测意义。细胞代谢组学自身的优势极为显著，价格低廉，且易把控，有着良好的重复性，在DH体外评价中得到了广泛应用。而质谱技术也有独特优势，经1次检测便可得到代谢物的诸多信息，例如峰强度/面积、精确质荷比、特征离子、同位素分布等等[3]。液相色谱-质谱联合应用后，还将彰显出良好的灵敏度、分离度，且其重现性也较为明显，对代谢组的定量分析极为有着积极作用，数据库还能鉴定相关代谢物，在代谢组学研究中具有显著的应用价值[4]。质谱成像又为新一代的分子影像技术，可在相关的生物样品中提取诸多的内外源代谢物和药物信息。在质谱技术之下，能够反应药物刺激后出现的时空改变，在DH研究中具有良好的可行性，应用价值高。现本文将基于质谱技术的代谢组学予以分析，力求为体外DH评价提供相关参考，提升药物研发质量。

1 DH评价细胞模型

要想做好体外DH的准确评价，必须找到适宜的肝细胞类型，并选择具有针对性的方法培养。现将列举常见的细胞类型，并总结其优点与问题。

1.1 DH评价的典型细胞类型

（1）原代肝细胞。该细胞主要来源于肝脏，属其分离物，其中含有较高的转运体与药物代谢酶，属于DH细胞模型与外源性化合物代谢一种“金标准”[5]。同时，在代谢酶的抑制和诱导中也有着一定价值，并且还能实现化合物的筛选。不过，常态化的二维单层培养模式时间较长，肝细胞特异功能会在时间的延长下不断降低，功能维持时间仅在24-72小时左右。

（2）干细胞样细胞。在干细胞培养技术研究的不断深入下，干细胞衍生肝细胞系逐渐走进临床，并在肝细胞模型中得到了大面积使用。该细胞能够实现多能干细胞的诱导，并可衍生干细胞，在肝毒性研究中应用较广。不过，现在临床还未找到可直接分化为完全成熟肝细胞的干细胞，见其仅具有相应的干细胞特征，进行干细胞的诱导重建期间易发生分化异质性与遗传改变，和成熟人体肝细胞表型存在一定相似之处，但相似比例较为有限[6]。

（3）永生化肝细胞系。该细胞系的获取方法主要有两种，其一为经原代肝细胞基因改造而成;其二便是在突变肝肿瘤中分离所得。永生化肝细胞系优势较为显著，增值能力强，且具有无限性的特点，培养成本也较低。现阶段，临床在研究肝肿瘤细胞系时常将HepG2与HepaRG两种细胞作为主要细胞，分析原因，主要在于其细胞的稳定性强，同时获取容易，且具有无限增殖的能力[7]。另外，上述2种细胞皆具有较高的CYP450活性。不过，该细胞也存在一定的不足，由于其基因型较为单一，只可代表单个供体，在特异性人群中的适用性不高，在肝功能标志物表达中则体现为较低水平。

1.2 细胞模型培养方式

相比体内的肝组织，二维方式培养的肝细胞无通讯和空间的异质性，并且也无细胞外基质，无法进行肝脏功能与其结构的维持，稳定性不足，在药物毒性测试中的适用性不佳。而三维细胞模型同人体肝组织较为相似，能够实现细胞表型相关性的改善，同时还可将模型生存能力得以延长[8]。经培养所得的三维结构，会模拟药物的渗透过程对DH评价有着积极作用，准确度也较高。

目前，在研究的不断深入下，也出现了新型的培养方式，如肝芯片、肝细胞球等，对抑制性微环境中的细胞模型有着积极作用。在过去的研究中，一般会选择琼脂糖进行96孔板凝固凹形表面细胞球的培养，但当下的3D打印技术发展较为成熟，琼脂糖凹形微孔阵列模型的构建将变得更加精准，在3D肝细胞球形模型下，可使细胞表达出成熟的肝细胞标志物，故药物自身的敏感性将变得更高[9]。器官芯片也属体外3D细胞模型，在制造微芯片后，能够构建出微流控细胞模型，可模擬器官和相关组织的生理环境。在此技术下，各种类型的细胞均能以空间方式一起培养，并不断模拟出机体细胞中的微环境，价值显著。

2基于质谱技术的细胞代谢组学分析

2.1 液相色谱-质谱联用技术

（1）制备样品。相比尿液、血浆等生物样品的代谢组学研究，细胞样品的前期处理十分复杂，包括细胞的采集、淬灭、破碎、提取等诸多环节[10]。因此，必须找到高效且科学的细胞样本前期处理对策，确保细胞代谢物的稳定和真实，奠定细胞代谢组学研究的基础。在李丽美等人[11]的研究中，在细胞样品的前期处理中，加入了LC-MS技术，并进行每一处理环节的优化和改良，找到了最佳的样本前期处理办法，将细胞用PBS清洗2次后，再以零下40度的甲醇（60%）进行细胞代谢淬灭（时间把控在5分钟内），随后再以甲醇（80%）进行细胞代谢物的提取。另外，该研究中还发现，收集批次与液氮冻存时间的差异，也会影响细胞代谢物，因此，在相关研究开展过程中，尽量选择同批次且培养条件相同的细胞样本，以降低误差。

（2）技术与方法。在代谢组学样品分析过程中，色谱与质谱技术是应用频率最高的。相比液相色谱，气相色谱能够减少基质效应，同时还可降低洗脱化合物离子抑制影响，色谱分离的重复性与分辨率也更佳，在低分子质量挥发性化合物中有着显著价值。而液相色谱技术能够与极性代谢物相容，同时也被看作代谢组学分离的一种工具。一般情况下，LC-MS可经亲水作用色谱柱与反向柱进行代谢物的极性分析。如若单一分离技术无法检测时，可采取两种分离机制的色谱进行分离，对样品分析的覆盖范围和分辨率均有明显提升作用。

（3）采集数据。在进行数据采集过程中，有靶向与非靶向分析两种方法。非靶向代谢组学可实现样品代谢物的全面分析，对新型生物标志物有发现作用，不过处理时的工作量较大，效率不高。而靶向代谢组学则主要涉及已知代谢物组的测试。此外，也有研究提出把向与非靶向结合应用的方法，在非靶向下可分析出代谢物的信息和离子特征，提升数据处理的准确性与特异性，确保已知和未知代谢物均能实现检测，重复性较高，且有着较宽的线性范围，处理过程也相对简便。

（4）处理分析。使用代谢组学分析时会有大量数据产生，因此，必须做好相应的分析与处理。首先，应过滤噪声，提取峰，解卷积峰，时间保留对齐等操作，确保原始数据能够转换，使得每一样本中的离子、强度矩阵、峰面积等均可被检出。随后，再进行数据的多元处理，结合代谢谱做到样本聚类。另外，还可使用新型的统计方法与计算方法，将模型进行優化，例如，随机森林、自组织映射，支持向量机等，得到贡献值较大的差异变量。

2.2 基于质谱成像技术体外细胞模型

在质谱成像技术中，空间分辨代谢组学能够将代谢物进行有效保留，确保异质性生物的空间位置信息能够及时反馈，并扩展至二维或三维层面中，完成生物代谢的研究。现阶段，质谱成像技术中的基质辅助激光解析电离质谱、二次离子质谱、解吸电喷雾电离质谱等的使用频率均较高。

基质辅助激光解析电离质谱的分辨率通常处于50-100μm，最高能够至微米状态，对宽质量范围也有着良好的分析性，尤其在体积较小的生物组织样本质谱成像中的优势最为明显[12]。针对多细胞肿瘤球（1μm直径）内的西妥昔单抗与哌立福新等药物的代谢、渗透也有表征作用。

二次离子质谱可展现出亚微米、纳米等级别的空间图片，分辨率较高，对单细胞、亚细胞质谱研究均十分有益。相关研究便对该技术进行了有效分析，发现其在单细胞和相关代谢物中均具有可视化效果，不过以高能离子束轰击样本，便会有诸多的碎片离子产生，因此在使用该技术时，无法进行内源性代谢物的有效检测，同时分子质量超过1000u的化合物也不适用，灵敏度不高。

解吸电喷雾电离质谱具有敞开式特征，操作十分便捷，在分析样本的过程中也不会依靠喷涂基质，即使物质的质量区较低，也可获得良好的检测结果，可覆盖较宽范围内的代谢物，且灵敏度高。有研究便进行了该项技术的使用和研究，发现其可将内源性分子空间分布可视化，缺氧微环境与肿瘤异质性区域均可被表征，可知晓多细胞肿瘤球的中心坏死位与外周增殖范围[13]。不过，该项技术的空间分辨率不高，仅处于100μm上下，因此在表征体外的3D细胞球时，会出现一定的代谢差异，局限性明显。

3总结展望

使用人源细胞进行DH评价存在较多的优势之处，有着良好的可控性，且重复性高、时间短，并且还能降低动物成本。肝细胞自身的选择与培养方式在DH评价中具有显著的作用价值，在3D细胞培养模型下，对其性能有提升作用，同时还可保证肝脏特异功能，使毒副反应预测的结果更加准确。仅凭单一的细胞模型无法实现体内肝细胞状况的有效分析，因此还需进行细胞毒性评价模型的持续研究。

基于质谱细胞代谢组学技术与许多生物学技术均能实现有效融合，同时还可弥补其中的不足之处，在毒理学机制评价、生物标志物评价中均具有显著的应用成效。现阶段，分析技术依旧面临着诸多的机遇和挑战，不足之处也十分明显。而二维液相色谱分离技术能够弥补1次分析中的覆盖度与分辨率，同时还可促进代谢物灵敏度的提升，效率也较高。当质谱成像技术出现后，又能实现药物渗透、代谢等的反映，对细胞代谢组时空改变均有明显益处，在可视化之下完成药物、代谢物与细胞代谢的分析，价值显著，同时也能帮助临床理解药物毒性与其机制。

把细胞代谢组学中得出的DH生物标志物用在临床中，同时进行药物安全性评价，虽然已经取得了一定应用成效，但其实际的安全性与效果也依旧还需持续研究和证实。若把计算机与代谢组学联系起来，并进行相关风险评估，将实现代谢信息的有效发现与使用，把毒性相关代谢变化与药物结合后，还可帮助更好的预测DH风险。结合细胞模型与代谢组学后，对临床DH的预测极为有益，目前已经在中药和化学药DH中取得了一定成效，基于3D细胞模型，研制出体内微环境的DH系统，将促进生物药物毒理学的发展，可为其提供新的方向和思路。

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