胚胎绒毛细胞培养及核型分析在自然流产病因检测中的应用

冯王富，张春玲，赖宾霞，谢文光，曾研章，何晓颜，陈文锋

阳江市妇幼保健院检验科，广东 阳江 529500

自然流产是目前妇产科临床实践中较为常见的一种病症。临床研究显示，约有15%的女性会在孕早期发生原因不明的自然流产[1-3]。而从病理机制的相关研究来看，自然流产的发生不仅与多种外在环境因素的影响有关，也有较高比例的自然流产直接与胎儿的遗传基因异常或缺陷有关[4-5]。但随着染色体核型分析技术的不断进步，越来越多的医院开始针对孕早期妇女开展绒毛细胞检测，由于绒毛细胞是受精卵分化而来的中胚层细胞组成，其组织染色体与胎儿具有同源性，因此对于胎儿染色体的异常与否具有良好的检验和预测价值。本研究以改良式绒毛细胞培养法对早期自然流产的绒毛细胞进行培养，观察早期流产胎儿的染色体异常状况，以便对后续研究提供一定的参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018 年5 月至2021 年5 月间于阳江市妇幼保健院进行常规妊娠检查并确诊为“胚胎停育”的73例早期流产孕妇作为研究对象，所有孕妇均符合以纳入和排除标准。纳入标准：①流产前B超检查显示胎儿已停止发育，未见心管搏动及胎芽；②孕周≤15 周，符合孕早期特征；③孕妇及其家属同意进行流产绒毛染色体检测。排除标准：①临床检查资料不全，不便开展临床研究；②孕期存在严重感染或孕期存在有害有毒物接触史。73例孕妇年龄21～43岁，平均(27.65±4.24)岁；孕周6～15 周，平均(9.85±1.24)周。本研究经我院医学伦理委员会研究审核通过。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及培养 在孕妇同意进行流产绒毛组织染色体检查后，于清宫手术中进行标本采集工作。具体流程：①在无菌操作流程下于孕妇宫内取出流产绒毛组织，将取出的绒毛组织置于2 只含有1万U硫酸链霉素和青霉素的培养皿中进行清洗，以去除可能影响后续检测结果的凝血块及非绒毛组织；②挑选15～30 mg 优良绒毛置于15 mL 离心管口并用手术剪将绒毛组织剪成较为均匀的小枝，于离心管内加入5 mL 的0.25%胰蛋白酶培养液与人胎盘绒毛膜细胞完全培养基，置于37℃下进行3 min消化，消化中每1 min 摇匀一次离心管；③消化完成后加入5 mL 培养液，置于离心机内1 800 r/min 进行10 min 离心，保留下层沉淀混合物，混匀后分为2份分别加入5 mL培养瓶中，置于二氧化碳培养箱内进行培养；④培养7 d后取出组织块进行观察，当组织块周围出现梭形细胞增殖及双圆形细胞时提示可以进行换液，换液后继续培养1～2 d即可进行收获，同时于换液时将2份旧培养基分别移入新离心管其中一份进行传代培养使用另一份作为传代培养的备用培养基于冰箱内0～4℃保存；⑤旧培养基于离心机内1 800 r/min 进行10 min 离心，保留下层沉淀混合物加入5 mL新培养基混匀后置入新培养瓶，培养瓶瓶盖保持旋松状态，并将培养瓶置于二氧化碳培养箱中进行传代培养。

1.2.2 细胞收获及阅片 加秋水仙素(20 μg/mL)

两滴2.5小时后，用刮刀刮下贴壁细胞，然后用生理盐水冲洗，放进15 mL离心管中。离心去上清，然后于培养瓶中加入已完成预温的氯化钾溶液，利用吸管充分吹打混匀后进行水浴箱温育。温育完成后加入1.5 mL已完成预温的固定液(甲醇冰醋酸溶液)进行预固定，混匀后置于水浴箱中再次温育并离心。保留下层沉淀混合物再次加入8 mL固定液，以水浴法温育后再次离心固定，重复两次固定。固定完成后再次加入固定液将下层沉淀混合物调匀为混悬液，滴取于冰片上后放入烤箱，75℃烤片3 h。选取常规G 显带，经胰酶消化漂洗后与姬姆萨溶液内进行染色2 min，然后冲洗吹干进行阅片。进行核型分析时每例样本进行20 个分裂相计数，并分析5个核型，当核型分析出现嵌合体时计数加数50个核型，并计算嵌合比例。

2 结果

2.1 培养结果 在采用改良式原代培养联合传代培养所培养的73份样本中，原代培养共培养成功胚胎绒毛细胞65例，培养过程中出现8例污染未贴壁生长，但借助传代培养和备用培养基进行再次培养成功4 例，4 例培养失败，共培养成功69 例，成功率为94.52%(69/73)。

2.2 胚胎绒毛染色体核型分析结果 69 例细胞样本中检出染色体异常核型45 例，占所有样本的65.21%；正常核型24 例，占所有样本的34.78%。其中，常染色体三体共14例，占异常核型的31.11%；性染色体单体共9例，占异常核型的20.00%；双重三体共3例，占异常核型的6.67%；多倍体共10 例，占异常核型的22.22%；嵌合体共5例，占异常核型的11.11%；结构异常共4 例，占异常核型的8.89%。69 例自然流产患者的胚胎绒毛细胞染色体核型分布情况见表1，45 例胚胎绒毛细胞染色体异常核型的分布情况见表2。

表1 69例自然流产患者的胚胎绒毛细胞染色体核型分布情况

表2 45例胚胎绒毛细胞染色体异常核型的分布情况

3 讨论

原发性自然流产是目前临床上较为棘手的一类病症，由于致使自然流产的潜在因素较多，临床治疗中主治医师难以从常规的检查资料中判断患者的病因所在[6-7]。同时从现有研究来看，随着孕产妇自然流产发生的次数增加，其再次发生自然流产的概率也随之增加，这不仅会导致孕产妇出现习惯性流产，同时也会给患者及其家庭带来极大痛苦[8-10]。因此，在未能确认自然流产的病因之前，应嘱咐患者短时间内不再制订妊娠计划，以进行综合检查和治疗干预来减少自然流产再次发生的可能[11]。

从相关的病因检测研究来看，多数早期自然流产的成因依然是染色体异常，尤其是在孕期＜12 周的孕早期患者当中，染色体异常的比例高达50%～70%[12-14]。但由于传统绒毛组织长期培养法的局限性，这些研究的绒毛细胞培养过程中难免会受到样本污染、孕周误差和患者停孕时间的影响，多数针对胚胎绒毛细胞培养的研究培养成功率只有60%～80%，从而使最终得出的数据和结论存在一定误差和局限，且培养失败的另一部分患者由于无法再提取绒毛组织故而无法继续进行诊断[15-16]。而本研究采用目前较为新颖的改良式原代培养结合传代培养及备用培养基的培养模式，避免了因操作失误或是采集污染导致培养基无法贴壁生长的缺陷，虽有一部分培养基在原代培养中出现了未贴壁生长的情况，但在传代培养的后续工作中均完成了胚胎绒毛细胞收获，从而在研究方法上规避了传统方法所对研究带来的影响。而从研究结果来看也有力证实了这一点，在充分把握原代培养工作的准确性之上以传代培养作为保险能有效确保胚胎绒毛培养检查的成功率。而从研究的培养结果来看，73 例样本中检出45 例异常核型染色体，异常核型检出率为65.21%，与谢金芳等[17]的研究结果基本一致。从45例异常核型的分布情况来看，非整倍体核型是占比最多的，尤其以性染色体单体和常染色体三体最多，从其发生机制上来看，非整倍体核型的出现主要与受精卵分化时染色体不分离或染色体缺失造成的，如典型的45，X 核型的发生主要因为父亲一方染色体的缺失所导致[18]。除了非整倍体核型外，本研究还发现了一定比例的多倍体核型，且根据患者的临床资料进行回顾分析，这些三倍体病例其术中所得的绒毛组织均呈现水泡状，推测此部分患者存在部分性葡萄胎，存在双雌受精的情况；研究中还发现了两个较为罕见的四倍体病例，推测其与细胞核内染色体正常复制后的核膜粘连存在一定关系，遂而出现四倍体的情况。而从嵌合体的观察结果来看，均可能与卵裂后出现的细胞系不分离有关，随着细胞系不分离时间的拉长，嵌合体中部分染色体的比例便逐渐减小，更加难以检出，遂而产生较多的46/47 型嵌合体。而从核型结构异常的几个病例来看，其中3 例经外周血染色体溯源已证实为遗传所致，剩余1 例则未在患者夫妇外周血染色体中检出，推测为新发染色体结构异常，与环境因素所导致的突变有关。

综上所述，胚胎染色体异常是依然是目前临床自然流产的首要可能考量的病因之一，借助于更为先进的原代培养联合传代培养法可有效提升胚胎绒毛细胞的培养成功率，以便在后续核型分析中针对患者夫妇双方提出具有针对性的检查建议，以减少自然流产再次发生的可能。