芍药受体再生系统的建立

程 婉，康 静

（沈阳城市学院，辽宁沈阳 110000）

植物遗传转化（plant genetic transformation）是应用重组DNA 技术、细胞组织培养技术或种质系统转化技术，有目的地将外源基因或DNA 片段插入到受体植物基因组中，并使其在后代植株中得以表达的过程[1]。植物遗传转化可以定向改变植物遗传信息，改善育种进程，提高植物抗性，获得性状良好的转基因植物。建立高效的再生受体系统是基因遗传转化的基础，基因转化需要有大量且质量优良的受体来接受外源基因的整合，通过鉴定有更多的受体实现基因的表达，从而筛选出转基因再生植株。目前，由于芍药间接途径诱导不定芽困难，增殖较慢，直接途径诱导不定芽数量少，不易再生，阻碍了芍药在分子生物学上转基因研究的发展，因此为芍药建立高效、稳定的受体系统迫在眉睫。

1 材料与方法

1.1 实验材料

外植体：愈伤组织、芍药试管苗的子叶；抗生素：潮霉素（Hygromycin）、庆大霉素（Gentamicin）、头孢霉素、羧苄霉素。

1.2 选择抗生素的确定

将芍药试管苗的子叶接种于培养基MS+6-BA 1.0mg/L+GA30.5mg/L。将芍药愈伤组织分成大小均匀小块，接种于培养基MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 2.0mg/L。在以上2 种培养基中，分别添加不同浓度庆大霉素、潮霉素，观察子叶不定芽生长情况和愈伤组织分化、褐化情况，确定遗传转化选择压和最佳转化受体。

1.3 抑菌抗生素的确定

将芍药试管苗的子叶接种于培养基MS+6-BA 1.0mg/L+GA30.5mg/L。将芍药愈伤组织分割成大小均匀的小块，接种于培养基MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 2.0mg/L。在以上2 种培养基中，分别添加不同浓度头孢霉素（Cefotaxime）、羧苄霉素（Carbenicinin），观察子叶不定芽生长情况和愈伤组织块分化、褐化情况，确定遗传转化选择压和最佳的转化受体。各种抗生素浓度见表1。

表1 抗生素浓度表

1.4 数据统计

不定芽分化率（%）=分化的外植体/接种的外植体总数×100。

2 结果与分析

2.1 子叶对抗生素种类和浓度的筛选

由表2 可知，在添加不同种类和浓度的选择抗生素培养基中，子叶分化不定芽的效率不同。试验发现，在添加潮霉素培养基中，不定芽生长较慢，随着浓度的增大，子叶对潮霉素的敏感度不断增大，分化率逐渐下降。结果表明，当潮霉素浓度为2 mg/L 时，分化率最大为75.57%，但与空白对照相比，下降了11.33 百分点。当潮霉素浓度为8mg/L 时，分化率较低，为2.67%；当潮霉素浓度为10mg/L，分化率为0，且子叶生长势较弱，出现萎蔫甚至死亡。所以，当潮霉素浓度为8mg/L时，可作为芍药遗传转化的选择压。当在培养基中加入庆大霉素时，不定芽在5mg/L 时分化只有7.76%，当浓度为10mg/L 时，分化率为0，说明子叶对庆大霉素的敏感度过高，因此庆大霉素不适宜作为选择抗生素。

表2 Hyg 和Gen 对子叶不定芽分化的影响

由表3 可知，在添加不同种类和浓度的抑菌抗生素培养基中，子叶分化不定芽效率均受到一定程度的抑制。试验发现，在添加头孢霉素培养基中，不定芽生长虽受到抑制，但是抗敏感度较高，当浓度为50mg/L，分化率为71.1%，当浓度达到150mg/L，依然有16.67%子叶可以分化不定芽。而在加入羧苄霉素的培养基中，当浓度为50mg/L 时，分化率就已经降低到38.9%，所以羧苄霉素不适宜作为抑菌抗生素，可选择头孢霉素50mg/L 作为芍药遗传转化过程中的抑菌剂。

表3 抑菌抗生素对子叶不定芽分化的影响

2.2 愈伤组织对抗生素种类和浓度的筛选

由表4 可知，在添加不同种类和浓度的选择抗生素培养基中，愈伤组织分化不定芽的效率不同。试验发现，在添加潮霉素培养基中，不定芽生长较慢，随着浓度的增大，子叶对潮霉素的敏感度不断增大，分化率逐渐下降，褐化甚至死亡。结果表明，当潮霉素浓度为2mg/L 时，分化率最大为68.9%，但与空白对照相比，下降了15.53%。当潮霉素浓度为6mg/L 时，分化率较低，为6.67%；当潮霉素浓度为8mg/L，分化率为0，且愈伤组织生长势较弱，褐化现象严重甚至死亡。所以，当潮霉素浓度为6mg/L 时，可作为芍药愈伤组织遗传转化的选择压。当在培养基中加入10mg/L 庆大霉素时，不定芽分化只有5.57%；当浓度为15mg/L 时，分化率为0，说明愈伤组织对庆大霉素的敏感度过高，所以庆大霉素不适宜作为选择抗生素。

表4 选择抗生素对愈伤组织不定芽分化的影响

由表5 可知，在添加不同种类和浓度的抑菌抗生素培养基中，愈伤组织分化不定芽效率均受到一定程度的抑制。试验发现，在添加头孢霉素培养基中，不定芽生长虽受到抑制，但是抗敏感度较高，当浓度为100mg/L，分化率为71.1%，当浓度达到200mg/L，依然有23.33%愈伤组织可以分化不定芽。而在加入羧苄霉素的培养基中，当浓度为100mg/L 时，分化率就已经降低到6.67%，所以羧苄霉素不适宜作为抑菌抗生素，可选择头孢霉素100mg/L 作为芍药遗传转化过程中的抑菌剂。

表5 抑菌抗生素对愈伤组织不定芽分化的影响

3 结论与讨论

试验结果表明：子叶和愈伤组织对抗生素均较为敏感，都可作为良好的受体。当以子叶为受体时，潮霉素的抗性质量浓度为8mg/L；头孢霉素为50mg/L 时，农杆菌生长可完全受到抑制。以愈伤组织为受体时，潮霉素的抗性质量浓度为6mg/L，头孢霉素为100mg/L时，农杆菌生长可完全受到抑制。

3.1 抗生素筛选对遗传转化的影响

农杆菌介导法是最有效的植物基因遗传转化的方法之一，因其价格低廉、操作简便、可导入的目的基因片段大、拷贝数低、不易发生重排、符合孟德尔遗传定律等优点，所以植物可通过农杆菌介导法获得大量的转基因植物[2]。在农杆菌介导的遗传转化实验中，潮霉素和庆大霉素常被用作抗性选择压的筛选。头孢霉素和羧苄霉素常被用作抑制农杆菌过度生长的抑菌剂。由于不同种类抗生素在转化实验中所起到的作用不同，不同浓度抗生素对农杆菌的抑制效果不同，不同种类植物和外植体对抗生素的敏感反应也存在差异。在培养基中添加抗生素后，抗生素对植物的分化和生长发育有一定的影响[3]，因此，通过筛选试验确定出最佳的抗生素使用范围和临界值，对从事遗传转化研究有重大的意义[4-5]。潮霉素、庆大霉素、羧苄霉素、头孢霉素作为常用的抗性筛选标记基因和抑菌剂被广泛用于植物的遗传转化工作。由于芍药不同外植体的生长状态和分化能力间存在差异，不同形态的外植体对不同抗生素的反应不同，所以在转化之前需对以上几种抗生素的使用浓度进行探讨。

3.2 抗生素不同种类和浓度对不定芽分化的影响

适合的抗生素浓度是在不影响细胞正常生长的前提下，有效抑制非转化细胞的生长[6]。在转基因实验中，通常导入的目的基因会对抗生素产生抗性，从而进一步筛选转化植株和非转化植株，并将非转化植株数量控制在最小范围内。本试验表明，潮霉素和庆大霉素对子叶和愈伤组织的分化均具有抑制作用，潮霉素的抑制作用更加显著，更适宜作为选择剂使用。潮霉素对不同外植体的分化作用也不尽相同，在同一浓度潮霉素下，子叶的不定芽分化率更高。所以选子叶作为外植体遗传转化受体更佳。

当植物材料经农杆菌浸染后，需及时用抗生素有效杀死并抑制农杆菌生长，以防危害外植体的生长和分化，其中杀菌和抑菌效果最好的是头孢霉素（Cef）和羧苄霉素（Carb）。然而抗生素对各种植物的组织分化影响不一[7-9]。因此，要测试植物对不同种类抗生素的敏感性，以确定抗生素筛选的临界浓度，并选择抑菌效果好、对植物组织再生影响较小的抗生素进行除菌，这是农杆菌介导的遗传转化成功的关键之一。

本试验通过对芍药愈伤组织和子叶2 种外植体在不同种类及浓度的抗生素中不定芽再生效率的研究，筛选了不同外植体各自的最佳抗生素和脱菌抗生素的质量浓度。结果表明，芍药愈伤组织和子叶对抗生素敏感，都可作为遗传转化的良好受体。以子叶和愈伤组织2 种不同的受体分别建立了较为完整的芍药遗传转化受体系统，为进一步进行芍药分子生物学转基因方面的研究奠定了基础，同时为芍药基因克隆、分子鉴定等研究提供理论依据。