原子力显微镜分析激光消融对牙本质表面微纳米结构的影响

林琪 林昱 谢云德 马忠雄

福建医科大学附属口腔医院口腔黏膜科，福建省口腔疾病重点实验室，福州350002

直接或间接修复体的粘接强度影响修复的远期效果，釉质的粘接通过酸蚀等途径较易获得令人满意的粘接强度，但牙本质的粘接效果较差，提升牙本质粘接强度是口腔临床工作面临的重要挑战。

近年来，饵激光家族中新型的掺铒铬钇铝石榴石激光（Erbium，Chromium:Yttrium-Scandium-Gallium-Garnet，Er，Cr:YSGG，λ=2.78μm）凭借其安全、快速、精确等显著的牙体硬组织作用优势成为研究热点[1]。文献[2-3]报道，激光辐照时，其波长能够被牙体组织中水、羟磷灰石（hydroxyapatite，HA）和胶原纤维吸收而产生消融作用，表层牙体硬组织及其中的水分被迅速加热，其中的水被瞬间蒸发，水蒸气在辐照区域导致局部内膨胀，当膨胀力量超过牙体结构的晶体结合力时，牙体结构发生消融破坏[4]。当选用较短脉宽铒激光并伴随喷水冷却情况下辐照硬组织时，辐照区域产生的热量很少传播到邻近正常牙体组织，但随着激光能量的增高，激光光能引起辐照区域温度升高使组织内压力增大，在提高硬组织消融效率的同时还会影响辐照区域组织发生局部物理、化学性能改变；更高剂量下进行激光辐照，可能引起组织熔融改变。但激光热机械消融的过程对牙本质表面理化性质造成的影响仍缺乏研究，激光辐照可能引起组织熔融改变，影响组织表面形貌及理化性能，从而改变后续粘接修复。

激光照射对牙本质粘接强度的影响各持所见，过往研究[5]显示，Er，Cr:YSGG激光有助于提高牙本质粘接强度，也有研究[6]表明该激光对牙本质粘接强度是负面的影响。因此，有必要从更微观的角度来探讨激光对牙本质表面粘接界面的影响。通常的检测手段都是用粘接力、剪切力实验来证明激光对粘接强度的影响，或是简单的用扫描电镜图来解释激光照射增加牙体表面粗糙度，从而增强粘接效果。本研究运用原子力显微镜（atomic force microscopy，AFM）研究人牙本质在6.18～11.1 J·cm-2的Er，Cr:YSGG激光辐照前后，牙本质HA晶体微纳米结构、形貌的改变，同时可通过测量得到样品表面的三维图像，以及其硬度、弹性、摩擦力、粗糙度等物理特性，运用能谱仪（energy-dispersive spectroscope，EDS）分析有机成分的改变，并探讨相应的变化趋势，以期对后续粘接剂的改良或激光专用型粘接剂的使用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 激光设备

本研究所用激光设备是波长为2.78μm的Er，Cr:YSGG激光（BioLaser Technology，BioLaser，美国），该激光最大输出功率：6.0 W，输出能量范围：0.25～6.0 W（步进0.25 W调节），激光通过光纤直径750μm，脉宽150μs，脉冲频率为20 Hz。

1.2 样本制备

选取10 d内拔除的无龋、无损伤、无脱矿及无发育不良的人第三磨牙共12颗（患者年龄在18～30岁，经患者知情同意），清洁并储存于4℃含0.5%氯胺T溶液中备用。用低速金刚石切片刀垂直于牙体长轴在水冷却下切除冠部1/3釉质及牙根，再垂直于牙体长轴切取1.0 mm厚度的牙本质片，每颗牙齿获得1个牙本质片。每个牙本质片用水砂纸逐步打磨，序列抛光（600、800、1 000、1 200、1 500、2 000目），最后布绒高度抛光，超声波清洗。

采用随机区组设计方法，将样本分成12个区组，每个牙本质片按顺序均匀取5个部位，根据随机数字表随机分配，分别选取0（空白组）、6.18、8.04、9.89、11.1 J·cm-2不同光剂量，激光通过光纤直径750μm的Tip进行传输，Tip离样品的距离为1 mm，脉宽150μs，脉冲频率为20 Hz，步控电机光学台控制扫描速度为1 mm·s-1，在气/水比例为60%/70%的喷雾下激光束垂直于样品表面进行面扫描。

1.3 AFM相位成像分析

将样本常规干燥，按照区组分别标记，应用AFM（NanoScopeⅢa Multimode，Veeco，美国）的相位成像技术，通过轻敲模式扫描过程中振动微悬臂的相位变化来检测激光照射部位，得出的phase图用于分析牙本质表面有机物、无机物比例的变化，并对牙本质表面粗糙度（Rq值）进行测量。

1.4 AFM微纳米形貌结构观察

室温下使用AFM对激光照射部位牙本质表面颗粒形貌进行观察，采用轻敲模式成像，探针材料为硅，微悬臂的共振频率为300 kHz，弹性系数为40 N·m-1，图片像素采集点为256×256，扫描频率为1.5 Hz。

1.5 EDS成分分析

样本按照区组分别标记，用EDS（Pheonix 60S，EDAX，美国）进行微区化学成分分析。EDS所得数据应用SPSS 22.0统计软件进行随机区组设计的方差分析及多个样本均数间多重比较的LSD检验。

2 结果

2.1 激光照射前后牙本质有机/无机成分检测

不同能量激光照射部位牙本质表面phase图见图1，无机相颗粒衬度较高（黄白色部分高衬度像为无机质），有机相衬度低（灰黑色部分低衬度像为有机质），相邻的高衬度颗粒间有低衬度像包绕，高衬度与低衬度像相互交织，彼此连接紧密。激光照射前，高衬度部分占大范围，低衬度部分占小范围（图1a）；激光照射后，低衬度部分范围减少，高衬度部分的相对比例增加，相邻的高衬度颗粒间连接紧密（图1b～e）。phase结果表明随着激光强度增强，表面有机物被消融数量增加，露出无机物表面，即有机质所占的比例减少，无机质所占比例进一步增加。

图1 不同能量密度激光照射后牙本质表面phase图Fig 1 Phasediagram of dentin surfacewith different Er，Cr:YSGGlaser irradiation

2.2 激光照射前后牙本质表面粗糙度测量

利用软件对进一步对不同激光照射部位牙本质表面粗糙度进行测量。经Kruskal-WallisH检验分析，各组之间差异具有统计学意义（P＜0.05）。对不同能量密度与粗糙度之间做Spearman秩相关分析，结果显示激光照射能量与粗糙度呈正相关，且相关性具有统计学意义（P＜0.01），说明激光照射强度的增强能明显增加牙本质表面的粗糙度（图2）。

图2 不同能量密度激光照射与牙本质表面粗糙度的关系Fig 2 The roughness of dentin surface with different Er，Cr:YSGG laser irradiation

2.3 激光照射前后牙本质纳米颗粒形貌观察

利用NanoScope（R）Ⅲ5.30r1软件对不同激光照射部位牙本质样本进行三维处理，获得激光辐照部位牙本质HA纳米颗粒的AFM形貌图。在1μm尺度下获得牙本质表面的纳米颗粒见图3。激光照射前，牙本质表面纳米颗粒界限较为清晰，排列紧密，颗粒大小均一（图3a）；不同能量密度的激光辐照后，牙本质表面部分纳米颗粒相互团聚，颗粒大小不均一，但仍可见清晰的纳米颗粒形态，未见完全融合、增大的纳米颗粒（图3b～e）。

图3 1μm尺度下牙本质表面纳米颗粒AFM图Fig 3 AFM images of dentine surface at 1μm scale

在650 nm尺度下，激光照射前，HA晶体呈颗粒状，暴露的HA颗粒大小较均匀，暴露端为半球形，颗粒间镶嵌排列且较紧密（图4a）。激光照射后，部分纳米HA颗粒相互团聚，堆垛状成簇排列，颗粒大小不均一，但仍可见颗粒间存在界限（图4b～e）。

图4 650 nm尺度下牙本质表面纳米颗粒AFM图Fig 4 AFM images of dentine surface at 650 nm scale

2.4 表面元素分析

EDS测试结果显示牙本质中除了主要的Ca、P、O、C元素外，还含有微量元素Na、Mg、Cl。不同激光照射部位C、O、Ca、P、Na、Mg元素及C/Ca、Ca/P比值（重量比）改变趋势见图5。

图5 不同能量密度激光照射前后牙本质表面化学成分变化Fig 5 Chemical composition of dentine samples with different Er，Cr:YSGGlaser irradiation

采用随机区组设计资料的方差分析，结果显示Er，Cr:YSGG激光照射后不同处理组牙本质表面元素总体均数不全相等（P＜0.05）。故进一步进行多个样本均数间多重比较的LSD检验（表1），结果显示激光照射后牙本质表面C、O、Na元素及C/Ca比值下降，Ca、P元素及Ca/P比值上升，与空白组相比差异有统计学意义（P＜0.05），但4种不同能量密度间激光照射后C、O、Ca、P、Na元素及C/Ca、Ca/P比值差异无统计学意义（P＞0.05）。说明Er，Cr:YSGG激光辐照会造成牙本质表面C、O、Na元素及C/Ca比值下降，Ca、P元素及Ca/P比值上升。激光照射对各处理组间Mg元素的差异无统计学意义（P＞0.05），说明Er，Cr:YSGG激光辐照不会引起牙本质表面Mg元素的改变。

表1 不同处理组间的牙本质表面化学成分差异性比较Tab 1 Comparison of chemical composition of dentin surface between different treatment groups ±s

表1 不同处理组间的牙本质表面化学成分差异性比较Tab 1 Comparison of chemical composition of dentin surface between different treatment groups ±s

注：各处理组间均数的LSD法多重比较结果用上标字母表示，每行中上标字母相同者差异无统计学意义（P＞0.05），字母不同者差异具有统计学意义（P＜0.05）。

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3 讨论

3.1 Er，Cr:YSGG激光照射后牙本质有机物及表面成分改变

探讨牙本质有机胶原对粘接强度的影响时，早期的研究一直着眼于牙本质粘接混合层的形成方面。1982年Nakabayashi等[7]首次提出混合层概念，即酸蚀处理后牙本质表面脱矿，暴露出胶原纤维，粘接剂单体渗入该胶原纤维网中聚合反应后，生成的聚合物与胶原纤维相互缠绕在一起，形成了一个机械固位层。粘接树脂和牙本质表面暴露胶原纤维在分子水平相互交联，构成了树脂-牙本质粘接强度的机械力学来源。随着研究深入，发现化学作用是另一种重要的粘接力来源，胶原蛋白也起重要作用。Betancourt等[8]认为，胶原中的游离胺基、亚胺基、羟基和羧基，均可为粘接剂与牙本质的化学结合提供活性基团，粘接剂与这些离子、基团形成络合或螯合键、离子键以及共价键，产生牢固的结合力。

胶原纤维的结构完整性及理化性能对粘接强度和持久度具有重要作用。然而，Sheth等[9]研究发现，胶原纤维温度耐受能力较差，人牙本质表面温度为60～80℃时，牙本质胶原纤维即开始变性、凝固或坏死；当温度达100～300℃时，牙表面脱水，蛋白质和脂类等有机物发生碳化。上述改变将明显影响复合修复材料的粘接强度。本实验phase结果表明Er，Cr:YSGG激光照射牙本质表面有机质的减少，推测激光照射导致表层胶原纤维在瞬间的高热高压作用下发生变性、凝固，这样的变化不利于后续良好粘接强度的获得。有研究[10]表明，粘接时酸蚀处理可以增大塌陷胶原纤维束之间的空隙，促进粘接树脂渗透，在一定程度上恢复胶原纤维的原有网状空间结构。激光处理后牙本质再使用磷酸酸蚀可恢复胶原纤维网混合层的形成，提高激光蚀刻后牙本质的粘接效果[11]。因此，激光照射后对牙本质有机质的损伤，可以通过辅助使用酸蚀处理的方法得以弥补，进而弱化激光辐照处理对后期粘接强度的影响。同时，激光照射前后牙本质表面粗糙度增加，有助于提高后期的粘接强度。

EDS测试数据统计结果显示激光辐照后C/Ca比例明显下降，但各能量密度之间C/Ca比变化差异无统计学意义，此结果与phase结果说明，能量密度在6.18～11.1 J·cm-2之间，采用Er，Cr:YSGG激光辐照牙本质会引起牙本质表面的有机质分解，且在6.18 J·cm-2能量密度下就足以引其上述反应。EDS结果中，Ca、P元素的明显升高提示激光照射后牙本质表面的溶解度下降，可能在一定程度上增强牙本质表面抗酸性，此与Resende等[12]的研究结果一致。激光照射使牙体硬组织成分发生改变，有机物、碳酸盐及水含量减少，并导致牙本质溶解性降低，抗酸性增强。然而牙本质溶解性降低、抗酸性增强是否会影响牙体修复时粘接剂与牙体组织间的渗透、聚合仍有待进一步的研究。

3.2 Er，Cr:YSGG激光照射后牙本质表面纳米微形貌改变

铒激光消融牙体硬组织的机制为：激光辐照牙体组织时，在短时间内表层牙体硬组织及其中的水分被迅速加热，其中的水被瞬间蒸发，水蒸气在辐照区域导致局部内膨胀，当膨胀力量超过牙体结构的晶体结合力时，牙体结构发生消融破坏[13]。上述微爆效应从激光照射的瞬间便开始，一直持续到激光能量下降。牙体硬组织消融点经历了碳化、熔融、粗糙、熔化、重结晶、弹坑状形成等过程，并在牙本质表面形成类似于经酸侵蚀后的不规则坑状结构[14]。根据Lin等[15]的研究，CO2激光照射过程中发生了牙本质晶体的重结晶及晶体尺寸的增大。Nd:YAG激光也得到了类似的结果[16]。HA晶体有相当比例的离子位于晶体的表面或接近表面，有不同的理化活性，晶体的形态改变有可能影响表层硬组织的化学稳定性及与粘接材料的作用模式和效果。本研究结果证实在6.18～11.1 J·cm-2能量密度下，Er，Cr:YSGG激光辐照产生的热机械过程会造成牙本质表面纳米晶体的团聚，但未见到明显的纳米微形貌的改变。同时，该激光即使在6.18 J·cm-2能量密度下辐照牙本质，都会造成有机质的减少。

综上所述，应用Er，Cr:YSGG激光在6.18、8.04、9.89、11.1 J·cm-2的能量密度下辐照人牙本质，均会造成牙本质表面有机质所占的比例减少，无机质所占比例相对增加。说明在此强度下，有机质逐渐被烧灼破坏、无机质含量升高。在微纳米晶体形貌方面，激光照射会造成牙本质HA纳米颗粒相互团聚，但仍可见颗粒间存在清晰的界限及纳米颗粒形态，未见完全融合、增大的纳米颗粒。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。