甜菜组蛋白乙酰转移酶（HAT）超家族成员的鉴定与表达模式分析

蒋依辰，王琳玉，于清洋，邳植

（黑龙江大学现代农业与生态环境学院，哈尔滨 150080）

0 引言

甜菜（Beta vulgarisL.）是苋科甜菜属二年生草本植物，主要分布在我国内蒙古和新疆自治区、黑龙江省、吉林省、宁夏回族自治区等地[1]。每年甜菜产糖量占我国食糖总产量的10%～20%，是我国主要的糖料作物[2]。盐渍、低温、干旱等非生物胁迫会导致甜菜的萌发率降低，幼苗生长状态差，块根发育减缓，严重限制了甜菜的产量和含糖率。因此，解析甜菜对非生物胁迫的适应机制对进一步提高甜菜产量具有重要意义[3]。研究表明，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（Peroxidase，POD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）组成的抗氧化酶系统是甜菜抵御非生物胁迫的重要方式之一。BvP5CS、BvCOLD1和BvCBL4等参与干旱、低温和盐胁迫的应答基因也被成功克隆[4-5]。然而，目前针对甜菜的非生物胁迫研究多集中在生理、转录和蛋白水平，表观遗传调控如何参与甜菜非生物胁迫应答目前研究较少。

组蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等翻译后修饰是表观遗传调控的重要方式之一[6]。20 世纪60年代，ALLFREY 等[7]第一次研究出乙酰基团能与核心组蛋白的赖氨酸残基连接从而产生乙酰化修饰，这种修饰会促进基因的转录。此后，大量关于组蛋白修饰及其对染色质重塑和转录调控的机制陆续被发现。组蛋白的乙酰化修饰是由组蛋白乙酰转移酶（HAT）将乙酰辅酶A 中的乙酰基转移到特定的赖氨酸残基，从而中和赖氨酸侧链的正电荷的过程。该过程会减弱组蛋白与DNA 的亲和程度，增加侧链的疏水体积，破坏氢键的形成能力，使染色质结构松散，有利于转录因子或转录调节蛋白与DNA 的结合，促进基因的转录[7-8]。根据HAT 的结构和性质，植物HAT 可以分为GNAT 家族、MYST 家族、CBP 家族、TAFII250 家族[9]。GNAT/MYST 超家族成员在动物、真菌和植物中具有较高的保守性。其中，GNAT家族的成员含有motif A～D 4 个特征基序，而MYST 家族仅含有特征motif A。CBP 家族成员涉及调节细胞周期控制、分化和凋亡。与动物CBP 家族成员相比，植物CBP 家族成员缺少bromodomain、KIX、Glutamine-rich 结构域，但具有zf-TAZ 和PHD 结构域[10]。TAFII250 家族成员作为TFIID 转录因子的一个亚基，含有与其他HAT家族成员不同的乙酰化修饰结构域[10]。

研究表明，HAT 在调控非生物对植物的胁迫中有重要的作用。拟南芥gcn5 突变体中许多热响应基因在被热激后无法被正常诱导表达，导致突变体表型在热激响应上有缺陷[11]。进一步研究表明AtGCN5 能结合到热响应基因HSAF3和UVH6的启动子上，并影响其H3K9和H3K14 的乙酰化修饰水平[12]。在盐胁迫下，水稻的OsHAC701、OsHAC703、OsHAC704、OsHAG703和OsHAM701的转录水平增加，这种情况的产生与组蛋白H3K18乙酰化的增加有关，所以这些蛋白质可能在水稻盐胁迫反应中起重要作用[13]。

目前，关于组蛋白乙酰基转移酶的研究主要是以拟南芥、玉米、水稻为主要研究对象。甜菜组蛋白乙酰转移酶（BvHATs）家族成员的研究尚未有明确报道，也不清楚在哪些BvHATs 与胁迫响应相关。因此，本研究将利用同源比对的方法在甜菜基因组中检索BvHATs基因家族成员；对BvHATs基因家族进行系统进化、基因结构和功能结构域分析；通过分析非生物胁迫下基因表达模式筛选胁迫相关的BvHATs，以期为阐明BvHATs家族基因的功能及其调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 不同物种基因组数据的获取及HAT家族成员检索

本研究从Phytozome、CoGe、URG、TAIR 等数据库分别检索下载拟南芥、甜菜、大豆、胡萝卜等13 种植物的蛋白质组数据（表1）。以拟南芥HAT 蛋白序列进行Blastp 检索[14]。以E-value<1E-15 且score 值>50 为阈值[15-16]，从13个植物蛋白质组数据中检索的HAT家族成员进行系统进化树的构建。

表1 研究所用蛋白质组数据Table1 Theproteomic databaseused inthis study

1.2 HAT基因家族系统进化分析的构建

利用Cluster Omega 对挑选出的HAT 进行序列比对，所有参数采用默认值[30]。随后，利用IQ-TREE 软件采用最大似然法构建进化树[31]，基于蛋白序列比对结果以ModelFinder计算建树最优模型。最终，采用JTT+R5作为最优模型构建进化树，bootstrap设置为1 000[32]。建树结果使用EvolView进行可视化[33]。

1.3 BvHATs基因和蛋白质结构分析

基于甜菜基因组gff 文件利用TBtools 软件[34]从中提取HAT 基因家族成员基因组定位、外显子和内含子位置信息，并绘制染色体定位图谱。HAT 基因家族成员编码蛋白分子量和等电点通过Expasy 计算，蛋白功能结构域信息则通过HMMscan进行检索。

1.4 非生物胁迫下BvHATs基因表达模式分析

目前SRA 数据库中仅有盐胁迫（PRJNA453103）和碱胁迫（PRJNA420895）后的甜菜转录组数据。因此，BvHATs 基因在盐胁迫和碱胁迫下的表达模式通过SRA 数据获取，低温胁迫下的表达模式利用RNA-seq 对低温处理后甜菜实验进行转录组测序。将甜菜‘KWS9147’播种于方盆中（12 cm×12 cm×10 cm），在温度（24±2）℃、光照强度为200µmol/(m2·s)、光周期16 h/8 h 条件下进行培养。将生长24 d 的甜菜幼苗分别进行常温（24 ℃)和低温（4 ℃）培养24 h 后剪取叶片进行总RNA 的提取。随后，通过RNA-seq 获得低温胁迫前后甜菜转录组数据。盐胁迫和碱胁迫叶片转录组数据则从SRA 数据库中获取。盐胁迫处理条件为土培浇灌含有300 mmol/L NaCl 霍格兰营养液处理21 d；碱胁迫处理条件为水培pH9.67 碱性霍格兰营养液（含50 mmol/L NaHCO3和25 mmol/L Na2CO3）处理7 d。甜菜转录组数据采用Salmon 对基因进行定量，计算各转录本TPM值，获得BvHATs在低温胁迫、盐胁迫、碱胁迫下的表达模式。

2 结果与分析

2.1 HAT家族基因的系统发育分析

为明确HAT 家族成员之间的系统发育关系构建系统进化树（图1），7 个BvHATs 分别属于GNAT、TAFII250 和CBP 家族。GNAT 家族含有4 个甜菜基因，CBP 家族含有2 个甜菜基因，TAFII250 家族含有1 个甜菜基因。BvHATs 常与菠菜、绿穗苋、藜麦等苋科植物HAT 位于同一亚枝，而与十字花科（拟南芥、芜菁）、豆科（大豆、豌豆）植物常位于不同亚枝。这说明苋科内HAT家族成员保守性较强，苋科HAT 可能与其他科属植物HAT的具有不同的调控功能。

图1 HAT基因家族系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of HAT gene family

2.2 BvHATs的理化性质

BvHATs 编码蛋白在氨基酸长度、分子量大小和等电点上都存在着一定的差异性（表2）。GNAT 家族成员的氨基酸数目在461～753 aa，蛋白质分子量在51.8～83.3 kDa，蛋白等电点在5.32～8.73。与其他的CBP和TAFII250 家族成员相比，具有较小蛋白质分子量，氨基酸数目均在1 000 aa以下。2个CBP家族的成员氨基酸长度均在1 500 aa 左右，分子量分别为160.8 kDa和187.9 kDa，等电点分别为6.53、8.53。TAFII250 家族的Bv3_058510_ugws的蛋白质序列较长，达到1 904 aa，蛋白质分子量为215.0 kDa，等电点为5.58。

表2 甜菜HAT基因家族信息Table2 Theinformationof HATfamilyin sugarbeet

2.3 BvHATs的染色体定位分析

为了解BvHATs在基因组的分布情况，利用TBtools软件进行了染色体定位分析，结果表明所有的BvHATs基因均位于核基因组（图2）。Bv2_026300_ydyh定位于Chr2 染色体的上端。Bv3_058510_ugws和Bv4_085980_ujsz分别位于Chr3 和Chr4 染色体的中部位置。Bv5_120220_wckr则定位于Chr5 染色体的下端。在Chr7 染色体上分布有3 个基因，其中，Bv7_166250_wdiq定位到染色体上端，而Bv7_178170_nxgz和Bv7_178460_zusm并未确定在Chr7染色体中的具体位置。

图2 BvHATs基因染色体定位Fig.2 The distribution of BvHATs in the chromosome

2.4 BvHATs功能结构域分析

通过hmmscan 对BvHATs含有的功能结构域进行注释（图3）。GNAT 家族中，Bv7_178460_zusm.t1、Bv5_120220_wckr.t1、Bv7_166250_wdiq.t1都含有Acetyltransf_1或Acetyltransf_10这两个乙酰转移酶功能结构域，但Bv4_085980_ujsz.t1中未注释到相关结构域。除Acetyltransf结构域外，各GNAT家族成员含有的其他结构域差异较大。Bv7_178460_zusm.t1含有两个Radical_SAM 结构域，可以催化包括异常甲基化、异构化、硫插入、环形成、厌氧氧化和蛋白质自由基形成等多种反应。Bv5_120220_wckr.t1和Bv4_085980_ujsz.t1含有的bromodomain 结构域能够参与识别组蛋白赖氨酸乙酰化修饰并促进蛋白发生互作关系。CBP 家族的Bv2_026300_ydyh.t1、Bv7 178170 nxgz.t1皆含有HAT_KAT11 保守结构域。此外，Bv7_178170_nxgz.t1在HAT_KAT11 两端含有zf-TAZ 和ZZ 锌指结构，这与拟南芥等植物CBP 成员功能结构域分布相同。Bv2_026300_ydyh.t1两端缺少zf-TAZ和ZZ，但含有PHD 锌指结构。TAFII250家族成员Bv3_058510_ugws.t1含有保守的TFIID 转录因子亚基，并在其上游和下游分别含有ubiquitin 泛素化修饰结构域和bromodomain 结构域。这与拟南芥TAFII250亚家族具有相同的结构域特征。此外，Bv3_058510_ugws.t1还在N末端含有TATA盒结合蛋白结合结构域（TBP-bindingdomain），可能在调控目标基因表达中具有一定功能。

图3 BvHATs功能结构域分析Fig.3 Analysis of function domain in BvHATs

2.5 非生物胁迫下BvHATs表达模式分析

对BvHATs 家族基因在盐胁迫、碱胁迫和低温胁迫下的转录组数据进行分析（图4）。结果表明，BvHATs家族基因在不同非生物胁迫下呈现出不同的表达规律。在盐胁迫下，各个BvHATs 表达量均未发生显著变化。其中，Bv4_085980_ujsz在不同盐胁迫样品中表达量差异较大，部分样品中TPM 值为2～3，而在一些重复中TPM 值为0。除Bv3_058510_ugws、Bv7_166250_wdiq上调不显著外，其余BvHATs均在碱胁迫后表达量显著上调，但仅有Bv4_085980_ujsz变化倍数超过2 倍。在冷胁迫下，CBP家族基因Bv2_026300_ydyh表达量显著下调。

图4 不同胁迫下BvHATs的表达模式Fig.4 Expression patterns of BvHATs under various stresses

3 讨论与结论

组蛋白乙酰转移酶是一种重要的酶类，在转录激活、细胞周期调控、DNA 复制、修复等生理过程中起到很大作用[35]。HAT一共含有GNAT、MYST、CBP 和TAFII250四个基因家族[36]。通过比对拟南芥中已知HAT序列，在甜菜基因组中共鉴定到7 个BvHATs。从基因数目和系统进化树结果来看，GNAT 和TAFII250 家族基因在苋科和十字花科分化后没有出现明显的基因加倍事件，而拟南芥CBP 家族成员数目（5 个）明显多于甜菜（2 个）。同时，甜菜中缺少MYST 家族成员。这些结果暗示甜菜和拟南芥HAT 在调控生长发育和胁迫响应中可能存在一定差异。

研究表明，AtGCN5 能够与CBF1、DREB2A、AREB1～2 等胁迫响应相关的转录因子相互作用形成蛋白复合体，催化H3K9、H3K14、H3K27、H4K4、H4K5 位点的乙酰化修饰[37-39]。此外，AtHAC1、AtHAF2等基因也被发现参与盐胁迫、低温、光胁迫等应答过程[40]。BvHATs 是否参与盐胁迫和低温等应答过程值得探究。为此我们通过系统进化树分析和非生物胁迫下基因表达模式分析寻找可能的非生物胁迫应答BvHATs。通过系统进化树分析，筛选出Bv5_120220_wckr为AtGCN5的直系同源基因。但是系统进化树结果表明苋科植物与十字花科植物HAT分别形成不同亚枝，暗示其基因功能存在一定差异。根据不同胁迫下的表达特性分析可知，Bv5_120220_wckr仅在碱胁迫中基因水平显著上调，所以Bv5_120220_wckr是否参与甜菜盐渍、低温等胁迫仍需进一步研究。基于转录组数据分析发现多个BvHATs在盐碱和低温胁迫中表达模式发生显著变化。特别是CBP 家族基因Bv2_026300_ydyh在低温胁迫后表达量显著下调，暗示其参与低温应答过程。而Bv4_085980_ujsz和Bv7_178170_nxgz响应碱胁迫。这与拟南芥中低温、盐胁迫等多个非生物胁迫响应均由At-GCN5参与调控不同，甜菜中不同胁迫的应答可能由不同HAT 成员参与。综上，本研究为进一步阐明BvHATs功能及其调控机制提供了一定基础信息。