4 株鸡源多杀性巴氏杆菌生物学特性分析

于 勇，左家坤，王凯民，张 瑶，李思言，韩先干，孙学强

（1.南京农业大学动物医学院，OIE 猪链球菌病参考实验室，江苏南京 210095；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 730070；3.南京海关动植物与食品检测中心，江苏南京 210095；4.青岛立见生物科技有限公司，山东青岛 266144；5.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）是导致多种动物巴氏杆菌病的一种重要病原，属于巴氏杆菌科，为革兰氏阴性菌，有荚膜，无鞭毛，不运动，不能形成芽孢，亚甲蓝染色时呈典型双极着色。与大部分巴氏杆菌种属类似，多杀性巴氏杆菌通常是多种动物和鸟类正常口咽微生物群的组成部分，但同时它也是一种条件性致病菌，与多种动物呼吸道综合征密切相关[1]。多杀性巴氏杆菌广泛存在于世界各地，特别是澳大利亚、越南、加拿大和美国等国家流行严重[2-4]。该菌可导致一系列疾病暴发，如猪萎缩性鼻炎和禽霍乱等。我国学者对猪多杀性巴氏杆菌遗传特征有一定研究[5]，但对禽多杀性巴氏杆菌研究较少。

禽多杀性巴氏杆菌是危害家禽养殖业的重要病原菌之一，能够引起禽霍乱，导致家禽急性出血性败血症，死亡率高。此外，该病原菌通常与亚急性或慢性胸膜炎相关。研究[6]表明，禽多杀性巴氏杆菌具有遗传多样性，可以垂直和水平传播，其中通过呼吸道和消化道传播最常见，此外多杀性巴氏杆菌的种间传播也被认为可在某些条件下发生。

禽多杀性巴氏杆菌导致禽类死亡的病程从几小时到几天不等，其致病性强弱与携带的各种毒力因子（VFs）有关[7-9]，包括荚膜、脂多糖（LPS）、黏附素、铁调节系统、透明质酸酶、唾液酸代谢相关酶等，这些VFs 能够帮助多杀性巴氏杆菌入侵和抵御宿主的防御系统。研究[10-11]表明，荚膜血清型可能与巴氏杆菌病类型密切相关，根据荚膜抗原不同，多杀性巴氏杆菌主要分为5 个荚膜血清型（A、B、D、E 和F），分别由基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD调控。在我国，禽多杀性巴氏杆菌导致的禽霍乱广泛流行，但主要集中于南方地区，且以血清A 型为主。

目前，使用抗生素是预防和控制巴氏杆菌临床感染的普遍方法[12]，但其耐药性问题不可忽视[13-14]。本试验对4 株临床分离的鸡源多杀性巴氏杆菌的荚膜血清型、毒力基因、耐药性、生物被膜形成能力等进行分析，以期为禽多杀性巴氏杆菌的致病机制研究和临床防治提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株来源 鸡源多杀性巴氏杆菌Pm01 和Pm03 株，由安徽农业大学从某鸡场病死鸡肝脏中分离；1801 和1802 株，保种于中国农业科学院家禽研究所，从江苏省某鸡场病死鸡肝脏中分离。

1.1.2 培养基和试剂 DL 2 000 DNA Marker、2×HieffTMPCR Master mix 和琼脂，均购自上海翊圣生物科技有限公司；BHI 培养基，购自美国碧迪公司；M9 培养基，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；MgSO4和CaCl2，购自美国AMRESCO公司；细菌基因组提取试剂盒（DP302-02），购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 药敏纸片 甲氧嘧啶、恩诺沙星、阿奇霉素、克林霉素、大观霉素、红霉素、环丙沙星、利福平、复方新诺明、庆大霉素、氯霉素、四环素、卡那霉素、新霉素、氟苯尼考、阿莫西林、头孢噻吩、头孢曲松、头孢拉定和氨苄西林等20 种药敏纸片，均购自杭州微生物试剂有限公司。

1.1.4 试验动物 1 日龄三黄鸡200 只，购自上海市某养鸡场，按照相关动物福利规定饲喂至21 日龄。

1.2 细菌基因组提取

将4 株多杀性巴氏杆菌冻存株复苏后接种于BHI 培养基，37 ℃、200 r/min 培养至对数期；取1.0 mL 菌液至2.0 mL 离心管中，12 000 r/min离心2 min；弃掉上清，用细菌基因组提取试剂盒提取巴氏杆菌基因组，保存于-20 ℃，用于后续PCR 扩增鉴定。

1.3 毒力基因和荚膜血清型PCR 鉴定

按照Townsend 等[15]方法，通过PCR 扩增鉴定4 株多杀性巴氏杆菌的12 种毒力基因（toxA、pfhA、ptfA、nanH、nanB、exBDtonB、hgbB、hgbA、sodC、sodA、oma87、ompH）[16]，及5 种荚膜血清型基因（A 型hyaD-hyaC、B 型bcbD、D 型dcbF、E 型ecbJ和F 型fcbD）[17]。根据NCBI 相关参考序列，使用Primer 5.0 软件设计引物，引物序列和目的片段大小见表1，送上海桑尼生物科技有限公司合成。20 μL PCR反应体系：2×HieffTMPCR Master mix 10 μL，上下游引物各1 μL，多杀性巴氏杆菌菌株DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环；72 ℃延伸5 min。扩增产物通过0.8%琼脂糖凝胶电泳分析，并用凝胶记录系统记录结果。

1.4 耐药性试验

参照美国临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2015 年标准，采用纸片扩散法测定4 株多杀性巴氏杆菌的药物敏感性。将4 株多杀性巴氏杆菌分别在BHI 琼脂平板上划线，挑取单个菌落接种于5 mL BHI 液体培养基，37 ℃、200 r/min 培养至对数中期；用灭菌磷酸盐缓冲液稀释菌液，使其浑浊度与0.5 的麦氏比浊管相当；将稀释后的菌液分别均匀涂布于BHI 平板培养基表面，每块平板培养基上贴5 个药敏纸片，37 ℃培养16～18 h 后用游标卡尺测定各种药物抑菌圈直径，每株菌均检测20 种药物敏感性。抑菌圈直径标准评定参照美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）标准，抑菌结果分为敏感、中度敏感（简称“中敏”）和耐药。

1.5 生物被膜形成能力测定

对划线后的4 株多杀性巴氏杆菌分别挑取单个菌落接种于5 mL BHI 液体培养基，37 ℃、200 r/min 培养至对数中期；吸取50 µL 菌液接种至5 mL BHI 液体培养基中，37 ℃，静置培养至OD600nm=1.0，4 ℃离心收集菌体，使用BHI 基础培养液洗2 次；4 ℃离心收集菌体，分别用BHI、BHI+1%马血清、BHI+1%葡萄糖培养基重悬，并调整至OD600nm=0.3；分别吸取200 µL 菌液加至96 孔细胞培养板中，不同培养基重悬的每株菌重复6 孔，37 ℃静置培养36 h；小心弃去上清菌液，加入200 µL PBS 清洗3 遍，晾干后放入烘箱中烤20 min；加入0.1%结晶紫200 µL，37 ℃孵育染色15 min；弃去结晶紫，以PBS 清洗3 遍，自然晾干；加入95% 乙醇200 µL 溶解生物被膜，置于摇床（37 ℃、50 r/min）摇20 min，直至完全溶解，最后测定OD595nm。

1.6 半数致死剂量（LD50）测定

动物试验根据国际生物医学研究涉及动物的指导原则（1985 年）进行。将所购的200 只三黄鸡饲喂至21 日龄，随机挑选健康、体质量相近的136 只来测定多杀性巴氏杆菌株LD50。将4 菌株分别在BHI 平板上划线，置于37 ℃培养箱过夜培养；挑取单菌落置于BHI 液体培养基中，37 ℃、200 r/min 培养至对数中期；以PBS 洗涤2 遍，再用PBS 将每株菌稀释为2×104～2×101CFU/mL 4 个梯度（本试验前期已测定OD600nm=1.0 时，含菌量为3×108CFU/mL）；将136 只三黄鸡随机分成16 个试验组和1 个PBS 对照组（8 只/组），对不同试验组三黄鸡分别肌肉注射4 种菌株不同梯度剂量的菌液0.5 mL，即每株菌的攻毒剂量梯度分别为104～101CFU，对照组三黄鸡肌肉注射无菌PBS 0.5 mL；观察记录所有三黄鸡7 d 内的死亡数量，通过改良寇式法计算4 菌株的LD50。

2 结果

2.1 荚膜血清型鉴定

分别用多杀性巴氏杆菌5 种荚膜血清型引物，对4 株多杀性巴氏杆菌进行PCR 扩增。结果（图1）显示，4 株多杀性巴氏杆菌均为荚膜血清A 型，使用引物hyaD-hyaC-F/R 均能扩增出约l 000 bp 的片段，与预期条带大小相符。

2.2 毒力基因扩增

12 种毒力基因的PCR 扩增结果（图2）显示，4 株多杀性巴氏杆菌都含有pfhA、exBDtonB、nanB、oma87、ompH、hgbB、hgbA、sodC、sodA9 种毒力基因，而toxA、nanH、ptfA3 种毒力基因均没有被检测到。

2.3 耐药性试验

参照NCCLS 药敏纸片抑菌圈直径评定标准测定的结果（表2）显示：菌株Pm01 对克林霉素、红霉素、四环素、卡那霉素、阿莫西林、头孢噻吩和氨苄西林等7 种抗生素表现耐药；菌株Pm03 仅对四环素表现耐药；菌株1801 对克林霉素、大观霉素、四环素、卡那霉素和新霉素等5 种抗生素表现耐药；菌株1802 对克林霉素、大观霉素、四环素、卡那霉素和新霉素等5 种抗生素表现耐药。

表2 4 菌株耐药性试验结果

2.4 生物被膜形成能力测定

4 株多杀性巴氏杆菌生物被膜形成能力检测结果（图3）显示：菌株Pm03、1801 以及1803 几乎不能形成生物被膜；而无论马血清存在与否，菌株Pm01 生物被膜形成能力显著高于其他3 菌株，可形成极强的生物被膜（OD ＞3.0，P＜0.001）。

2.5 LD50 测定

使用4 株多杀性巴氏杆菌对21 日龄三黄鸡攻毒，统计攻毒后7 d 内三黄鸡的死亡情况。通过LD50校正公式计算的结果（表3）显示，菌株Pm01、Pm03、1801 和1802 的LD50分别为1.33×10、2.74×102、4.22 和4.22 CFU。

表3 4 菌株LD50 测定结果

3 讨论

引发巴氏杆菌病的临床菌株多为荚膜毒力较强的多杀性巴氏杆菌。目前世界范围内引发多杀性巴氏杆菌病的主要病原菌株包括5 个荚膜血清型（A、B、D、E 和F）和16 种血清型，且以A 型为主，主要引起禽霍乱、猪肺疫、兔巴氏杆菌病等。本研究中，4 株鸡源多杀性巴氏杆菌Pm01、Pm03和1801、1802 分别从安徽省和江苏省鸡场患有禽巴氏杆菌病的病死鸡肝脏中分离得到，通过荚膜血清型检测证明均为A 型。

禽巴氏杆菌能引起禽类急性出血性败血症，引起的病禽死亡率较高，且成年鸡或火鸡是其主要攻击对象。本研究中，4 株禽多杀性巴氏杆菌对鸡表现出很高的毒力，仅101～103个CFU 就能引起禽类发病死亡，推测这与禽多杀性巴氏杆菌携带的众多毒力基因有关，这些基因包括黏附素基因（pfhA）、铁摄取蛋白基因（exBDtonB、hgbB、hgbA）、唾液酸酶基因（nanB）、外膜蛋白基因（oma87、ompH）和超氧化物歧化酶基因（sodC和sodA）[9-11]。根据LD50测定结果，菌株1801 和1802 毒力明显强于Pm01 和Pm03，但4 株菌携带的毒力基因相同，出现这一结果的原因可能是存在其他未知毒力基因。

抗生素在动物养殖业尤其是养禽业细菌性疾病预防和治疗中的应用，虽然在生产环节带来了良好收益，但随着滥用问题的产生，也导致了日益严重的细菌耐药性威胁。研究[18]显示，临床分离的多杀性巴氏杆菌已对多种抗生素产生耐药性。胡恒龙等[19]对安徽省六安市禽多杀性巴氏杆菌进行耐药性调查，发现32 株临床株对林可霉素、复方新诺明、强力霉素和青霉素呈现出较高的耐药性。此外，近年来禽多杀性巴氏杆菌临床分离株多呈现出对四环素类药物的耐药性。本研究中4 株鸡源多杀性巴氏杆菌临床株同样对四环素表现了严重的耐药性。目前研究[20]认为，这种耐四环素类药物机制多是由于禽多杀性巴氏杆菌菌株的质粒或染色体上携带了一种或多种外排泵基因。

生物被膜是细菌附着在生物或非生物表面，并由胞外基质所包裹的系统化、组织化的细菌多细胞群落。生物被膜的形成有利于提高细菌对不利环境的抵抗，与细菌的致病性、耐药性密切相关。本研究中，相较于其他3 株多杀性巴氏杆菌菌株，无论马血清存在与否，菌株Pm01 都具有较高的生物被膜形成能力。同时，其药敏检测结果也呈现出更强的耐药性，对β-内酰胺类抗生素（阿莫西林、氨苄西林、头孢噻吩）均表现出耐药性，这一点与预期相符。此外，编码β-内酰胺酶的耐药基因也能够介导细菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性，具体机制需要进一步研究。虽然Pm01 菌株能够形成较强的生物被膜，但其毒力低于1801 和1802 菌株，说明禽多杀性巴氏杆菌的毒力与生物被膜形成能力不完全相关。