猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其主要抗原蛋白的原核表达

姜 伟，郭明佳，吴树康，金彩虹

（龙口市动物疫病预防控制中心，山东龙口 265701）

关键字：多杀性巴氏杆菌；分离鉴定；抗原蛋白；克隆；原核表达

猪出血性败血症，又称“猪肺疫”，是由多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）引起的一种以败血症和高度呼吸困难等为主要特征的烈性传染病。该病无年龄和季节特异性，所有年龄段的猪均易发病，一年四季均可发生，且常见于气温骤变等外界环境发生突变时，每年对全球养猪业造成巨大经济损失。Pm 是一种条件致病菌，在全球范围内广泛分布，常寄生于宿主咽喉等部位，可以感染包括家畜、家禽、野生动物及人类在内的多种宿主[1-3]。根据特异性荚膜（K）差异，Pm 可分为A、B、D、E 和F 5 种血清型，其中引起猪巴氏杆菌病的主要为B 荚膜型菌株。

Pm 含有外膜蛋白（Omps）、菌毒素（Toxin）、铁代谢相关蛋白（IROMPs）、裂解酶（AspA）和三聚体自转运蛋白（TAAs）等多种免疫原性蛋白。研究[4-6]表明，体外表达这些蛋白制备的亚单位疫苗均可给宿主提供部分免疫保护力。目前关于猪源Pm Omps 相关研究较多，而关于AspA 和TAAs 免疫原性情况则缺少相关报道，且对主要抗原蛋白免疫原性的系统比较也仍需研究。

本试验成功分离了一株猪源Pm，并以其基因组为模板成功克隆了5 个主要抗原蛋白基因（OmpH、OmpA、AspA、pIpE和TAA），随后利用原核表达系统成功表达了5 个重组抗原蛋白，为相关蛋白免疫原性研究及系统比较奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

营养肉汤（HB0108）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（HB4114）、胰蛋白胨大豆琼脂培养基（HB0177）、细菌生化鉴定管，购自青岛海博生物科技有限公司；细菌全基因组DNA 提取试剂盒（D1800）、质粒小量提取试剂盒（D1100），购自北京索莱宝科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker（3427A）、DH5α 感受态细胞（9057）、pMD18-T（6011）、BL21（DE3）感受态细胞（9126），购自宝生物工程（大连）有限公司；IPTG（GF101）、EasyTaqDNA Polymerase（AP111），购自北京全式金生物技术有限公司；ClonExpress®Ultra One Step Cloning Kit（C115-01），购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；Anti His-Tag Mouse Monoclonal Antibody（CW0286）、Goat Anti-Mouse IgG，HRP Conjugated（CW0102）、eECL Western blot Kit（CW0049），购自北京康为世纪生物科技股份有限公司。

1.2 病原分离与鉴定

1.2.1 病原分离与纯化培养 2021 年3 月，龙口市动物疫病预防控制中心收到该市某养猪场送检的发病死亡病料，根据其临床症状初步判断为疑似巴氏杆菌感染。采集发病死亡仔猪的肝脏和脾脏进行触片检测，经革兰氏和瑞氏染色并镜检；将采集的肝脏和脾脏等组织无菌接种于营养肉汤和胰蛋白胨大豆肉汤培养基，37 ℃恒温培养18～24 h，无菌挑取培养物采用“四线三区”法接种于胰蛋白胨大豆琼脂培养基，37 ℃恒温培养18～24 h，进行分离纯化。

1.2.2 生化鉴定 挑取可疑菌菇接种于胰蛋白胨大豆肉汤培养基，37 ℃恒温培养18 h，然后根据说明书无菌接种于细菌生化鉴定管中，37 ℃恒温培养24 h，最后将结果与伯杰氏手册进行比对。

1.2.3 PCR 鉴定 依据Pm 特异性基因Kmt序列，设计1 对特异性鉴定引物（P1/P2，表1）并送至上海生工生物工程有限公司合成。以分离株基因组为模板，采用P1、P2 引物进行PCR 扩增，将PCR 产物进行电泳回收后连接pMD-18T 载体，连接产物转化至DH5α 感受态细胞并涂布于含有氨苄青霉素的LB 固体培养基，37 ℃恒温培养16 h 后挑取单个菌落送至上海生工生物工程有限公司测序，并将测序结果在NCBI 上进行Blast 比对。

表1 PCR 鉴定所用引物信息

1.2.4Kmt基因遗传进化分析 从NCBI GenBank数据库中随机下载国内外已分离测序的PmKmt基因序列，使用DNAstar 及Mega 5.0 软件[7]对分离株及参考菌株Kmt基因序列进行同源性分析，并采用maxmium likelihood 方法构建发育进化树。参考序列详情见表2。

表2 参考菌株Kmt 基因序列信息

1.3 主要抗原蛋白基因克隆与原核表达

1.3.1 引物设计与合成 参考GenBank 中菌株Pm 8-6 全基因组序列（登录号CP040918），使用Primer 5.0 软件设计针对Pm 5 个主要抗原蛋白基因（OmpH、OmpA、AspA、pIpE和TAA）的上下游引物，并在引物两端加入针对表达载体的特异性同源臂，引物序列具体信息见表3。

表3 构建重组质粒所用引物信息

1.3.2 pCold-I 重组质粒构建 利用1.3.1 中设计的各基因扩增引物，以分离株全基因组为模板，PCR 扩增获得各基因目的产物；同时使用BamHⅠ和KpnⅠ限制性内切酶对原核表达载体pCold-I 质粒进行双酶切，将PCR 产物和双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳并回收目的大小位置条带；使用ClonExpress®Ultra One Step Cloning Kit 同源重组试剂盒连接线性化的pCold-I 质粒与带有同源臂的基因片段，连接产物转化至DH5α 感受态细胞后涂布于含有氨苄青霉素的LB 固体培养基，37 ℃恒温培养16 h；挑取单个菌落并鉴定，将阳性样品送至上海生工生物工程有限公司测序。

1.3.3 主要抗原蛋白基因原核表达与鉴定 使用质粒提取试剂盒，提取测序结果正确样品的重组质粒，将阳性质粒转化至BL21（DE3）感受态细胞后涂布于含有氨苄青霉素的LB 固体培养基，37 ℃恒温培养16 h；挑取单个菌落并扩大培养，按体积比1:1 000 比例取10 µL 菌液接种于10 mL 含有氨苄青霉素的LB 液体培养基，37 ℃培养至菌液OD450nm为0.4～0.5，加入终浓度为0.1 mmol/L 的IPTG 16 ℃低温诱导培养24 h；将培养物4 000 r/min离心15 min，弃上清后加入1 mL PBS 重悬，取40 µL 重悬后样品加入10 µL 蛋白上样缓冲液，变性煮样后进行SDS-PAGE 凝胶电泳，以His-Tag 单克隆抗体为一抗，HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗，对样品进行Western blot 检测。

2 结果

2.1 病原分离及鉴定

2.1.1 分离菌形态及培养特性观察 采集发病死亡仔猪脏器进行触片染色后镜检。革兰氏染色可见大量呈革兰氏阴性的大小不一的球杆菌（图1）；瑞氏染色结果显示，两极呈明显浓染，符合巴氏杆菌的染色特性。将无菌采集的脏器接种于营养肉汤培养基和胰蛋白胨大豆肉汤培养基，可见该分离菌在营养肉汤中生长贫瘠而在胰蛋白胨大豆肉汤中生长旺盛。在胰蛋白胨大豆琼脂培养基中，分离菌形成大小一致，带有淡蓝色光泽的湿润、圆形露珠样小菌落，将分离纯化所得菌株命名为LK01。

2.1.2 分离菌生化鉴定 根据说明书对各生化结果进行判定，并与伯杰氏手册进行比对。生化结果具体见表4，初步判定本次分离的病原菌为猪源Pm。

表4 分离菌株LK01 生化特性鉴定结果

2.1.3 PCR 鉴定 Pm 特异性基因Kmt的PCR 扩增结果（图2）显示，本次分离菌株可扩增得到大小约347 bp 的特异性片段，而阴性对照未扩增出相应片段。PCR 产物经回收后连接载体送至生物公司测序，将测序结果在NCBI 上进行在线Blast比对，发现分离菌株与其他PmKmt基因核苷酸同源性最高可达100%，因此确定本次分离菌株LK01 为猪源Pm。

2.1.4Kmt基因核苷酸序列遗传进化分析 从GenBank 数据库中下载已公布的14 个国内外Pm代表株序列，使用DNA star 和Mega 5.0 软件对LK01 株及其他Pm 毒株Kmt基因进行核苷酸同源性分析并构建系统进化树。结果（图3）显示，所有毒株共被分为两个大分支，且这两个分支的分类与分离菌株分离的时间、地区、宿主动物无明显相关性。本次分离菌株LK01 与CQ2、EGY45 和P2-09-12-15Lb 株的亲缘关系最近，其中CQ2 为国内牛源分离株。

2.2 主要抗原蛋白基因克隆与原核表达

2.2.1 主要抗原蛋白基因克隆及重组质粒构建以分离菌株LK01 全基因组DNA 为模板，对OmpA、OmpH、AspA、pIpE和TAA5 个主要抗原蛋白基因进行PCR 扩增，并对PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果（图4）显示，分别在819、582、1 419、1 017 和1 236 bp 处有与预期大小相符的特异性扩增条带。将PCR 产物回收后，采用同源重组方式与双酶切回收后的pCold-I 原核表达载体连接，将连接产物转化至DH5α 感受态细胞后挑取单个菌落送至生物公司测序。测序结果在线Blast 比对显示，扩增片段均为Pm 主要抗原蛋白基因。

2.2.2 重组抗原蛋白诱导表达

各重组蛋白Western blot 检测结果（图5）显示，分别在30.0、21.5、52.0、37.5 和45.5 kDa 处出现特异性条带，而诱导的空载对照未出现特异性条带，表明各个重组蛋白均成功表达。

3 讨论

Pm 是巴氏杆菌属中一种重要的条件性致病菌，可以感染马、牛、羊、猪、鸡、鸭等多种重要经济动物，常引起动物出现败血症等并导致死亡，造成了巨大经济损失。本试验从发病死亡仔猪脏器中分离出一株病原菌，经形态学观察、培养特性鉴定、生化鉴定及Kmt基因PCR 检测等综合分析，确定该分离株为一株猪源Pm。

近年来抗生素滥用导致多重耐药菌产生，而临床上常用猪巴氏杆菌病疫苗主要是采用荚膜抗原B 型的猪源Pm 经甲醛灭活制备，存在灭活不完全的潜在风险，同时灭活苗对同抗原型的保护力较好而对A 型和D 型Pm 的交叉保护力还有待提高。因此筛选出具有良好交叉免疫原性的抗原蛋白，研发单价或多价重组亚单位疫苗显得尤为重要[7-8]。OmpH和OmpA蛋白作为Pm外膜蛋白的重要组分，有研究[9-11]表明，单独或融合表达两个蛋白均可给宿主动物提供一定保护力，但保护力差于弱毒苗或灭活苗。脂蛋白pIpE 是另一类大量存在于Pm 外膜上的重要蛋白，研究[4，12]表明，体外重组表达的pIpE 蛋白不仅具有良好保护力，且对不同亚型Pm 具有一定程度的交叉保护性。三聚体自转运蛋白TAA 是在革兰氏阴性菌外膜上广泛分布的一类重要蛋白，影响病原菌对宿主细胞的吸附、侵袭以及生物膜形成[13]；天冬氨酸裂解酶AspA 蛋白是巴氏杆菌生命活动过程中一种重要分泌蛋白，该蛋白除了发挥其正常生物学功能以外也能给宿主动物提供较好的免疫保护力。这两类蛋白均可以作为研发新型亚单位疫苗的候选靶标[14-16]，但目前国内外相关研究较少，且关于猪源Pm 相关蛋白的研究还未见相关报道。

本试验成功分离了一株猪源Pm，并以其基因组为模板成功克隆了5 个主要抗原蛋白基因（OmpH、OmpA、AspA、pIpE和TAA），使用原核表达载体pCold-I 构建了相关基因的重组质粒，经Western blot 检测发现5 个重组蛋白均成功表达。本试验首次克隆并表达了猪源PmAspA和TAA基因，为相关蛋白免疫原性研究奠定了基础，同时也有助于对猪源Pm 常见抗原蛋白开展系统性比较，从而筛选出抗原性较强且能提供良好交叉保护力的抗原蛋白。