复方癸甲氯铵消毒剂杀菌影响因素及对空气现场消毒效果研究

郭长梅，高 琛，崔亮亮，王 彬，李贵玉，张继甫，赵红琼，刘旭东，郝智慧*

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.中国农业大学动物医学院，中兽医药创新中心，北京 100193；3.成都科宏达科技有限公司，四川 成都 611435；4.青岛农业大学农用生物制药实验室，山东 青岛 266109)

生物安全与公共卫生安全是人类生命健康的基本安全保障，关乎着国家的发展与社会的稳定。从2003年严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)的全球性暴发到2018年8月首次传入我国的非洲猪瘟病毒，再到2019年新型冠状病毒肺炎疫情的突然袭击[1-3]，严重威胁养殖业的发展与人类健康，给我国的生物安全和公共卫生带来了巨大的挑战。目前，消毒仍是预防和控制疾病最有效、最经济的重要措施之一[4-5]。因此，迫切需要开发广谱、高效、安全的新型消毒剂，而对消毒剂进行科学系统的评价十分重要。

大肠埃希氏菌是一种来自人类和脊椎动物肠道的共生细菌[6]，广泛存在于自然环境中。事实上，大多数大肠埃希氏菌被认为对人类无害[7]，然而，致病性大肠埃希氏菌是导致人和动物感染的常见病原菌之一，能够引发猪腹泻病、鸡大肠杆菌病等，影响畜牧业的发展。金黄色葡萄球菌广泛分布于空气、污水与土壤中，常驻于动物体表及上呼吸道，是兽医临床中常见的重要病原菌[8]，特别是金黄色葡萄球菌感染的奶牛乳房炎在世界范围内很普遍，严重影响牛奶产量和质量，这种感染的成本使金黄色葡萄球菌成为世界范围内最昂贵的传染性病原体[9]。

复方癸甲氯铵消毒剂是一种季铵盐类复方兽用消毒剂，主要成分为苯扎氯铵和癸甲氯铵，用于畜禽栏舍、兽医临床器械的消毒。为评价其消毒效果，本研究依据《消毒技术规范》(2002版)及《兽用消毒剂鉴定技术规范》(试行)[10-11]，选用兽医临床上常见的大肠埃希氏菌作为革兰氏阴性菌的代表菌和金黄色葡萄球菌作为革兰氏阳性菌的代表菌，在浓度为1∶1 000时，分别测定不同温度、pH以及有机物等不同因素的杀菌作用。考察其影响因素，在此基础上，选择猪舍和鸡舍分别开展了空气现场消毒研究，并与市面上销售的常见季铵盐类消毒剂癸甲溴铵溶液进行比较，评估该消毒剂对猪舍和鸡舍内细菌的杀灭效果，探讨其现场消毒效果，以期为其临床使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受试药物 复方癸甲氯铵消毒剂：含苯扎氯铵(含量规格95%，批号：1807050101)和癸甲氯铵(含量规格70%，批号：1808155104)，实验室自制，用于畜禽栏舍、兽医临床器械的消毒；对照消毒剂：癸甲溴铵溶液(含量规格：100 mL：10 g，批号190608，上海派斯德生化有限公司)，用于动物厩舍、饲喂器具、饮水等消毒。

1.1.2 菌株 大肠埃希氏菌CICC 10899(同大肠埃希氏菌8099)，购自中国工业微生物菌种保藏中心；金黄色葡萄球菌CICC 21601(同金黄色葡萄球菌ATCC 6538)，购自中国工业微生物菌种保藏中心。

1.1.3 主要试剂 营养琼脂培养基，北京陆桥技术有限责任公司产品；改良马丁琼脂培养基，北京奥博星生物技术有限公司产品；中和剂(5 g/L卵磷脂+30 g/L吐温-80的0.03 mol/L PBS)，自制；标准硬水，按照《消毒技术规范》(2002版)[10]的方法自制；盐酸、氢氧化钠、无水硫代硫酸钠，国药集团化学试剂有限公司产品；牛血清白蛋白，北京博奥拓达科技有限公司产品；小牛血清，上海源叶生物科技有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 立式自动压力蒸汽灭菌器(GI80DS)，致微(厦门)仪器有限公司产品；便携式细菌浊度计(WGZ-2XJB)，上海昕瑞仪器仪表有限公司产品；生化培养箱(LRH-250F)，上海一恒科学仪器有限公司产品；pH计(FE28)，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品；数显水浴恒温振荡器(SHZ-82A)，金坛市科兴仪器厂产品；(标准型)双人单面垂直净化工作台(SW-CJ-2FD)，苏州净化设备有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液的制备 试验菌为大肠埃希氏菌(CICC 10899)、金黄色葡萄球菌(CICC 21601)，取其分离培养的单个典型菌落接种于营养琼脂培养基斜面，37℃培养18 h～24 h。将新鲜培养的斜面上菌苔用磷酸盐缓冲液(0.03 mol/L PBS)洗下，稀释配制成含菌量为1×108～5×108CFU/mL试验浓度菌悬液。

1.2.2 温度对杀菌效果的影响 以大肠埃希氏菌(CICC 10899)、金黄色葡萄球菌(CICC 21601)为指示菌，设置2℃±1℃、10℃±1℃、20℃±1℃、30℃±1℃、40℃±1℃，以10℃为间隔。各组所用复方癸甲氯铵消毒剂浓度和作用时间分别为1∶1 000和1 min、2.5 min、5 min、7.5 min和10 min。通过悬液定量杀菌试验对比不同条件下的消毒效果，试验重复3次。

1.2.3 pH对杀菌效果的影响 以大肠埃希氏菌(CICC 10899)、金黄色葡萄球菌(CICC 21601)为指示菌，设置pH分别为x-4、x-2、x、x+2和x+4(其中x为消毒剂的原始pH)。各pH组所用复方癸甲氯铵消毒剂浓度和作用时间分别为1∶1 000和2.5 min、5 min和7.5 min。对消毒液pH的调节，先用pH计测定原消毒剂的pH，在偏酸时慢慢滴加氢氧化钠溶液，偏碱时慢慢滴加盐酸溶液以调整。随时用pH计测定消毒液的pH。当达到所要求的pH后，停止调整，进行随后的试验。通过悬液定量杀菌试验对比不同条件下的消毒效果，试验重复3次。

1.2.4 有机物对杀菌效果的影响 以大肠埃希氏菌(CICC 10899)、金黄色葡萄球菌(CICC 21601)为指示菌，设置无小牛血清对照组、含25%小牛血清组和含50%小牛血清组等3组。各组所用复方癸甲氯铵消毒剂浓度和作用时间分别为1∶1 000和2.5 min、5 min和7.5 min。通过悬液定量杀菌试验对比不同条件下的消毒效果，各组试验重复3次。

1.2.5 空气现场消毒试验 试验分为复方癸甲氯铵消毒剂高浓度组(1∶500)、中浓度组(1∶1 000)、低浓度组(1∶2 000)和对照组(1∶200)。用水代替消毒剂进行同步试验，作为空白对照。使用同批次中和剂、稀释液各1.0 mL，接种培养基，分别于消毒前、消毒后(10 min，30 min，60 min)进行标准5点采样，计算自然沉降率后计算杀菌率。

2 结果

2.1 温度对杀菌效果的影响

由表1、表2可以看出，复方癸甲氯铵消毒剂对大肠埃希氏菌在2℃作用1 min时的杀菌率高于99.9%，其余不同温度下分别作用1 min、2.5 min、5 min、7.5 min和10 min的杀菌率均为100.0%；对金黄色葡萄球菌在不同温度下作用不同时间的杀菌率均为100.0%。表明复方癸甲氯铵消毒剂1∶1 000稀释浓度对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的杀灭效果基本不受温度影响。

表1 温度对复方癸甲氯铵消毒剂杀灭大肠埃希氏菌影响的测定结果Table 1 The determination results of temperature on compound didecyl dimethyl ammonium chloride disinfectant against Escherichia coli

表2 温度对复方癸甲氯铵消毒剂杀灭金黄色葡萄球菌影响的测定结果Table 2 The determination results of temperature on compound didecyl dimethyl ammonium chloride disinfectant against Staphylococcus aureus

2.2 pH对杀菌效果的影响

表3和表4的结果显示，复方癸甲氯铵消毒剂经1∶1000稀释后，无论是对大肠埃希氏菌还是金黄色葡萄球菌，在pH为2.31、4.31、6.32、8.27、10.29条件下分别作用2.5 min、5 min和7.5 min的杀菌率均为100.0%。表明复方癸甲氯铵消毒剂1∶1 000稀释浓度对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的杀灭效果不受pH影响。

表3 pH对复方癸甲氯铵消毒剂杀灭大肠埃希氏菌的测定结果Table 3 The determination results of pH value on compound didecyl dimethyl ammonium chloride disinfectant against Escherichia coli

表4 pH对复方癸甲氯铵消毒剂杀灭金黄色葡萄球菌的测定结果Table 4 The determination results of pH value on compound didecyl dimethyl ammonium chloride disinfectant against Staphylococcus aureus

2.3 有机物对杀菌效果的影响

表5与表6的试验结果显示，复方癸甲氯铵消毒剂1∶1 000稀释后，无论是对大肠埃希氏菌还是金黄色葡萄球菌，在不同有机物浓度条件下杀菌率均为100.0%。说明该复方癸甲氯铵消毒剂1∶1 000稀释浓度对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的杀灭效果不受有机物影响。

表5 有机物对复方癸甲氯铵消毒剂杀灭大肠埃希氏菌影响的测定结果Table 5 The determination results of organic substance on compound didecyl dimethyl ammonium chloride disinfectant against Escherichia coli

表6 有机物对复方癸甲氯铵消毒剂杀灭金黄色葡萄球菌影响的测定结果Table 6 The determination results of organic substance on compound didecyl dimethyl ammonium chloride disinfectant against Staphylococcus aureus

2.4 空气现场消毒试验结果

由图1和图2可知，在猪舍中，复方癸甲氯铵消毒剂1∶500、1∶1 000和1∶2 000稀释消毒60 min时，杀菌率分别约为92.4%、86.2%和83.8%。在鸡舍中，复方癸甲氯铵消毒剂1∶500、1∶1 000和1∶2 000稀释消毒60 min时，杀菌率分别高于96.4%、94.3%和90.7%。

图1 复方癸甲氯铵消毒剂对猪舍空气菌现场消毒试验结果Fig.1 Field disinfection test results of compound didecyl dimethyl ammonium chloride disinfectant on air bacteria in pig houses

图2 复方癸甲氯铵消毒剂对鸡舍空气菌现场消毒试验结果Fig.2 Field disinfection test results of compound didecyl dimethyl ammonium chloride disinfectant on air bacteria in chicken houses

综上结果表明，复方癸甲氯铵消毒剂对猪舍和鸡舍中空气自然菌具有良好的消毒效果，且在猪舍和鸡舍中复方癸甲氯铵消毒剂1∶500、1∶1 000以及1∶2 000稀释在10 min、30 min、60 min的消毒效果等同或优于对照药物。

3 讨论

本研究结果发现，该复方癸甲氯铵消毒剂对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的杀灭效果基本不受温度影响，且不受pH和有机物的影响。通常温度越高，消毒效果越好。夏娌君等[12]报道戊二醛季铵盐复方消毒剂随温度的升高，杀菌效果越好，与本研究结果存在出入，在一定程度上说明复方癸甲氯铵消毒剂相比于戊二醛季铵盐复方消毒剂更有利于养殖场低温条件下的使用。pH能够影响大部分消毒剂的消毒效果，因此，合适的pH有利于发挥消毒剂的消毒作用。李小林等[13]研究发现pH对新型戊二醛-癸甲溴铵复合消毒剂的作用效果影响不大，与本研究结果基本一致。养殖场环境复杂，微生物表面往往会被家禽粪便等有机物覆盖，阻碍其与消毒剂接触，影响消毒。因此，受有机物影响越小的消毒剂越适合用于养殖场中。郭红霞[14]报道含戊二醛和双链季铵盐的复方戊二醛消毒剂对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的杀灭效果不受有机物的影响，与本研究结果一致。

实验室试验方法和现场消毒试验是对消毒剂进行消毒效果评价的两种方法。前者直观、可靠，结果具有一定的可信度。相比于实验室试验方法，现场消毒试验更能真实的反映出禽畜舍消毒前后的病原菌状况，说明实际消毒效果，为临床应用提供依据。在本研究中，复方癸甲氯铵消毒剂1∶500、1∶1 000和1∶2 000稀释消毒60 min后细菌数量均大幅度减少，说明其能够对猪舍和鸡舍的环境变差起到预防作用，但其杀灭效果较实验室杀菌效果略差，这可能是由于实验室条件可控，而猪舍、鸡舍环境复杂导致该复方消毒剂的消毒效果下降。因此，在实际应用过程中应对养殖场进行充分的清洁并考虑消毒剂的影响因素，根据实际情况合理使用消毒剂。

影响因素试验结果能够反映出复方癸甲氯铵消毒剂的实验室杀菌效果，为指导临床应用提供理论依据，但只是初步探讨了单一影响因素，对众多因素中何种因素占主导以及各因素之间是否相互影响，需要后期进行深入研究。通过综合分析自然菌空气消毒试验结果，可以得出复方癸甲氯铵消毒剂在猪舍和鸡舍的现场使用中都获得了良好的消毒效果，说明该复方消毒剂产品是一种可以发挥良好消毒效力的新型消毒剂，非常适合用于动物厩舍及养殖环境中，可以推荐使用。