板蓝根多糖在3D4/21/CD163细胞上对PRRSV感染过程的影响

刘 建，苏 科，朱世豪，樊俊洋，李倩楠，郝潇雅，杨明凡,2,3，张红英,2,3*

(1.河南农业大学动物医学院，河南郑州 450000；2.河南省动物性食品安全重点实验室，河南郑州 450000；3.郑州市中兽药研究与评价重点实验室，河南郑州 450000)

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus PRRSV)是引起猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的病原。该病以母猪晚期生殖障碍、仔猪呼吸窘迫、免疫抑制和持续性感染等为主要临床症状，是威胁当今养猪业最重要的疫病之一，给全球养猪业造成了巨大的经济损失，仅美国年均经济损失超过 5.6 亿美元[1]。

PRRSV属于动脉炎病毒科(Arterividae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)的成员，是一种基因组不分节、大小为15 kb、单股正链有囊膜的RNA病毒[2-3]。我国的流行毒株总体分属于4个谱系，即lineage1、lineage3、lineage5、lineage8，其中sublinege 8.7是我国流行毒株的优势谱系，其代表性毒株为经典毒株CH-1a和高致病性毒株JXA1等，其次是lineage1谱系，代表性毒株为HENAN-XINX、JL580，sublinege5.1谱系的代表毒株是VR-2332和BJ-4，其致病性相对较弱[4-5]。

目前防控PRRS主要采取弱毒苗和灭活疫苗预防，但由于弱毒疫苗存在散毒风险，而灭活疫苗免疫效果不佳，且PRRSV具有抗体依赖性增强作用，低水平抗体的存在反而有助于其感染增殖，加之病毒变异较快，故疫苗免疫效果并不理想[6-7]。PRRSV感染机体的巨噬细胞或单核细胞，导致宿主免疫功能低下，容易继发其他病原感染[8-9]。因此，多年来对PRRS防控药物及新型疫苗的研制一直是学术界研究的热点[10-11]。

板蓝根为中国传统中药，有清热解毒、凉血利咽功能。板蓝根多糖(IsatidisRadixpolysaccharides，IRPS)是板蓝根中具有抗病毒、免疫调节活性的一类物质[12]。板蓝根多糖体外可以抑制人流感病毒(H1N1和H3N2亚型)、禽流感病毒(H6N2和H9N2亚型)、猪流感病毒(H3N2亚型)增殖，或通过抑制流感病毒H1N1、H5N1亚型神经氨酸酶的活性或通过抑制TLR-3蛋白表达，或通过促进IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ的分泌等发挥抗流感病毒作用[13-15]。胡元亮等研究发现板蓝根多糖在体外可抑制新城疫病毒(NDV)的增殖[16]。板蓝根多糖在鹅胚内具有极强的阻断小鹅瘟病毒(GPV)感染、增殖和保护胚体组织器官免受其损伤的作用[17]。本实验室前期研究发现，板蓝根多糖对在 Marc-145细胞上增殖的PRRSV有较好的抑制作用[18]。

近年来，国内外广泛开展了中药抗PRRSV的试验研究[19]，但体外试验多用MA-104和Marc-145细胞，这两个细胞株来源于猴肾细胞，而PRRSV感染的靶细胞是猪肺泡巨噬细胞，两者差异较大。本试验使用永生化的猪肺泡巨噬细胞3D4/21/CD163作为PRRSV感染细胞，确定IRPS抗PRRSV的最佳浓度、作用方式和作用环节，为后续的IRPS抗PRRSV 作用机制研究奠定基础，为临床应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒与细胞 PRRSV BJ 4毒株(TCID50为10-5.667)和永生化传代猪肺泡巨噬细胞(3D4/21/CD163)均由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室惠赠。

1.1.2 板蓝根多糖 本试验中用到的板蓝根多糖由河南农业大学动物分子免疫学实验室提取并保存，多糖含量为94.67%。

1.1.3 主要试剂 RPMI 1640培养基(SH30809.01)，美国Hyclone公司产品；胎牛血清(FB15015)，美国CLARK公司产品；青链霉素混合液(p1400)，谷氨酰氨粉末(G0200)，胰蛋白酶(T1300)，二甲基亚砜(DMSO D8371)，MTT(M8180)，牛血清白蛋白(A8020)，北京索莱宝科技有限公司产品；PRRSV N抗体(bs-23941R)，北京博奥森公司产品；SYBR Green I(DRR041A)，日本Takara公司产品。

1.1.4 主要仪器 PCR仪(A48141)，美国ABI公司产品；荧光定量PCR仪(7500/Bio-RAD iCycler)，美国Bio-Rad公司产品；4℃离心机(Espresso)，CO2细胞培养箱(Qp-160)，细胞生物安全柜(1300-A2)，美国Thermo Fisher Scientific公司产品。

1.2 方法

1.2.1 板蓝根多糖对3D4/21/CD163细胞最大安全浓度研究 将3D4/21/CD163细胞以3×105个/mL的浓度铺于96孔板，每孔100 μL，板蓝根多糖用维持液稀释成初始浓度为2 mg/mL的溶液，再用细胞生长液连续倍比稀释为5个浓度梯度，每孔100 μL，每个稀释度6个孔，另设细胞对照和空白对照，置于37℃、5% CO2培养箱中继续培养48 h，于结束培养前4 h每孔加入10 μL MTT溶液，继续培养。培养结束后取出培养板，弃去上清，每孔加入100 μL DMSO，振荡10 min，置于酶标仪上测波长492 nm处的OD值。以MTT法检测药物对细胞的抑制率，采用SPSS软件Probit回归法计算药物的最大安全浓度。

药物抑制率(%)=(OD给药组-OD病毒对照组)/(OD细胞对照组-OD病毒对照组)×100%

1.2.2 板蓝根多糖抑制PRRSV增殖最佳作用方式和浓度研究

1.2.2.1 药物的预防作用 3D4/21/CD163细胞以3×105个/mL的浓度铺于24孔板，每孔500 μL，于37℃、5% CO2培养箱中培养，长成单层后，用维持液从最大安全浓度往下倍比稀释3个浓度，每孔加入300 μL药物，培养4 h后取出24孔板，弃上清，PBS洗2次，以100TCID50的浓度稀释病毒液，每孔加入300 μL，培养2 h后弃去上清，PBS洗2次,每孔加入500 μL维持液，继续培养48 h，提取RNA，用荧光定量PCR方法测定病毒拷贝数，确定板蓝根多糖对PRRSV是否有抑制其增殖的作用。

1.2.2.2 药物的直接杀灭作用 3D4/21/CD163细胞在24孔板中长成单层后弃去生长液，PBS洗两次，以100TCID50的浓度稀释病毒液，分别将各浓度药物与病毒混合，每孔加300 μL，于37℃、5% CO2培养2 h后弃去上清，每孔加入500 μL维持液，继续培养48 h。用荧光定量PCR方法确定板蓝根多糖对PRRSV是否有直接杀灭作用。

1.2.2.3 药物的治疗作用 3D4/21/CD163细胞在24孔板中长成单层后弃去生长液，PBS洗2次，以100TCID50的浓度稀释病毒液，培养2 h后弃去上清，PBS洗2次，用维持液从最大安全浓度往下倍比稀释3个浓度，每孔加入500 μL药物，继续培养48 h。用荧光定量PCR方法确定药物是否对病毒入侵细胞后有抑制作用。

1.2.3 板蓝根多糖作用于PRRSV复制环节的研究1.2.3.1 板蓝根多糖对PRRSV吸附环节的影响 以100TCID50的浓度稀释病毒液，分别将各浓度药物和病毒混合，每孔加300 μL，4℃吸附2 h后弃去上清，PBS洗两次，每孔加入500 μL维持液，37℃、5% CO2培养48 h。用荧光定量PCR方法检测板蓝根多糖对PRRSV吸附的抑制作用。

1.2.3.2 板蓝根多糖对PRRSV侵入环节的影响 以100TCID50的浓度稀释病毒液，感染3D4/21/CD163细胞，4℃吸附2 h后弃去病毒液，每孔加入500 μL维持液，转入37℃培养。分别在转入37℃ 的0、1、2 h加入最佳作用浓度的板蓝根多糖，继续培养48 h。用荧光定量PCR方法检测板蓝根多糖对PRRSV入侵宿主细胞的抑制作用。

1.2.4 板蓝根多糖抗PRRSV作用的确证

1.2.4.1 荧光定量方法检测PRRSV拷贝数 采用最佳给药途径、用最佳剂量的板蓝根多糖作用于PRRSV，设置细胞对照和病毒对照，分别在PRRSV感染3D4/21/CD163细胞后36 h、48 h、72 h，收取细胞和细胞上清样品，以荧光定量PCR方法检测板蓝根多糖在最佳作用浓度、最佳作用方式下对PRRSV拷贝数的影响。

1.2.4.2 间接免疫荧光检测药物对PRRSV的作用 采用最佳给药途径、用最佳剂量的板蓝根多糖作用于PRRSV，设置细胞对照和病毒对照，在PRRSV感染细胞后的第48 h收取细胞，用PBS洗3次，然后加入组织固定液，37℃ 30 min，PBS洗3次，向每孔加入5 g/L TritonX-100 15 min，PBS洗3次，加入50 g/L 牛血清白蛋白37℃封闭2 h。PBS洗3次，然后一抗孵育2 h，PBS洗3次，加入标记FITI标签的二抗孵育50 min，PBS洗3次，向每孔加入DAPI室温孵育10 min，PBS洗3次，最后加入60%甘油，荧光显微镜观察。

1.2.5 数据处理与分析 用prism8.0 和spss软件对数据进行分析处理，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

2 结果

2.1 板蓝根多糖对细胞的最大安全浓度测定

由1.2.1中的公式可以求出板蓝根多糖的最大安全浓度(表1)。当板蓝根多糖浓度为0.062 5 mg/mL时药物对细胞的抑制率小于10%，当药物浓度继续往低浓度稀释，药物对细胞的生长起到促进作用，所以IRPS对3D4/21/CD163细胞的最大安全浓度为0.062 5 mg/mL。

表1 IRPS在3D4/21/CD163细胞上的安全浓度Table 1 Safe concentration of Isatidis Radix polysaccharides on 3D4/21/CD163 cells

2.2 板蓝根多糖抑制PRRSV增殖的最佳作用方式和浓度

如图1所示，当药物浓度为0.062 5 mg/mL时，用药组细胞中病毒拷贝数显著低于病毒对照组(P<0.001)；当药物浓度为0.031 3 mg/mL时与病毒对照组无显著性差异；当药物浓度为0.015 6 mg/mL时显著低于病毒对照组(P<0.01)。不同浓度药物组的病毒拷贝数均显著低于病毒对照组(P<0.000 1)，见图2。当药物浓度为0.062 5 mg/mL 时低于病毒对照组拷贝数(P<0.05)，而其余浓度的药物组病毒拷贝数与病毒对照组无显著性差异(P>0.05)，见图3。此结果说明IRPS对PRRSV具有一定的预防作用和直接杀灭作用，且直接杀灭作用疗效最优。药物浓度为0.062 5 mg/mL时，3种作用方式均好于0.031 3 mg/mL和0.0156 mg/mL。后续IRPS对PRRSV的抗病毒确证试验采用0.062 5 mg/mL剂量的直接杀灭作用方式进行。

A.病毒对照组；B.0.062 5 mg/mL；C.0.031 3 mg/mL；D.0.015 6 mg/mLA.Virus control group;B.0.062 5 mg/mL;C.0.031 3 mg/mL;D.0.015 6 mg/mL图1 板蓝根多糖对PRRSV的预防作用Fig.1 Prophylactic effect of Isatidis Radix polysaccharides on PRRSV

A.病毒对照组；B.0.062 5 mg/mL；C.0.031 3 mg/mL；D.0.015 6 mg/mLA.Virus control group;B.0.062 5 mg/mL;C.0.031 3 mg/mL;D.0.015 6 mg/mL图2 板蓝根多糖对PRRSV的直接杀灭作用Fig.2 Direct killing effect of Isatidis Radix polysaccharides on PRRSV

A.病毒对照组；B.0.062 5 mg/mL；C.0.031 3 mg/mL；D.0.015 6 mg/mLA.Virus control group;B.0.062 5 mg/mL;C.0.031 3 mg/mL;D.0.015 6 mg/mL图3 板蓝根多糖对PRRSV的治疗作用Fig.3 Therapeutic effect of Isatidis Radix polysaccharides on PRRSV

2.3 板蓝根多糖作用于PRRSV复制环节的研究

如图4所示，当药物作用于病毒的吸附环节时，0.062 5 mg/mL 浓度的药物组细胞中的病毒拷贝数高于病毒对照组(P<0.05)，其余2个浓度药物组与病毒对照组无显著差异(P>0.05)。当药物作用于病毒的入侵环节时，不同时间点药物处理组的拷贝数均显著低于病毒对照组(P<0.0001)，见图5。此结果说明IRPS主要对RPPSV复制的入侵环节发挥作用。

A.病毒对照组；B.0.062 5 mg/mL；C.0.031 3 mg/mL；D.0.015 6 mg/mLA.Virus control group;B.0.062 5 mg/mL;C.0.031 3 mg/mL;D.0.015 6 mg/mL图4 板蓝根多糖对PRRSV吸附环节的影响Fig.4 Effect of Isatidis Radix polysaccharides on the adsorption of PRRSV

A.病毒对照组；B.0 h；C.1 h；D.2 hA.Viral control group;B.0 h;C.1 h;D.2 h图5 板蓝根多糖对PRRSV入侵环节的影响Fig.5 Effect of Isatidis Radix polysaccharides on the invasion of PRRSV

2.4 荧光定量方法检测PRRSV拷贝数

以最佳给药浓度和最佳给药方式的IRPS作用于PRRSV，从细胞中病毒的拷贝数可以看出，在36 h时病毒增殖达到最高峰，随着时间的延长，病毒拷贝数呈现下降的趋势。在36 h和48 h时用药组病毒拷贝数极显著低于病毒对照组(P<0.000 1)。

A.病毒对照组；B.板蓝根多糖处理组A.Virus control group;B.Treatment group of Isatidis Radix polysaccharides图6 不同时间点给药组和病毒对照组病毒的拷贝数Fig.6 Copies of virus in drug administration group and virus control group at different time points

2.5 间接免疫荧光检测IRPS对PRRSV的作用

如图7所示，DAPI染色后细胞核被染成蓝色，细胞对照组与用药组细胞核状态相近，细胞核圆润，染色后激发的颜色均一，病毒对照组细胞核皱缩，颗粒感强。FITC标记的N蛋白被染成绿色，细胞对照组无荧光，用药组荧光较弱，病毒对照组细胞荧光很强且连接成片，此结果说明IRPS有抗PRRSV的作用。

3 讨论

3.1 IRPS对PRRSV感染环节的影响

病毒的感染包括吸附、入侵、脱壳、生物合成、组装和释放几个环节，其中任一环节受到影响都可以干扰病毒的感染。板蓝根多糖对PRRSV不同感染环节的作用结果表明，在病毒入侵细胞环节时用IRPS处理，给药组病毒的拷贝数明显低于病毒对照组(P<0.001)，说明IRPS可以干扰PRRSV的入侵。PRRSV入侵猪肺泡巨噬细胞依赖于受体介导的内吞小泡和低pH介导的内吞通路[20]，IRPS在抑制PRRSV入侵细胞的过程中，是否通过影响内吞过程而抑制了病毒的入侵有待进一步研究。

3.2 IRPS不同给药方式对PRRSV增殖的影响

本试验中以3种给药方式研究了板蓝根多糖对PRRSV的抑制效果，结果表明，当药物浓度为0.062 5 mg/mL时，预防作用和直接杀灭作用效果极显著。在研究板蓝根多糖预防作用时先把药物作用于细胞4 h，可能提高了细胞的免疫力，或者封闭了某些受体，所以对病毒入侵有一定的抑制作用。在研究IRPS对PRRSV直接杀灭作用时，分别将各浓度药物和病毒混合后37℃作用于细胞，2 h后弃去，这种作用方式与研究病毒的入侵环节接近，其结果与IRPS能够抑制PRRSV对宿主细胞的入侵一致。

A.细胞对照组；B.病毒对照组；C.板蓝根多糖处理组a.各组细胞核染色结果；b.各组免疫荧光结果；c.荧光融合结果A.Cell control group;B.Virus control group;C.Treatment group of Isatidis Radix polysaccharidesa.Nuclear staining results;b.Immunofluorescence results;c.Fluorescence fusion results图7 各组荧光染色结果Fig.7 Fluorescence staining results of each group

王学兵[21]等发现板蓝根多糖在Marc-145细胞上对PRRSV具有较好的阻断(相当于本试验中的预防作用)和抑制作用(操作方法相当于本试验中的治疗作用)，而本试验中的治疗作用虽有效，但逊于预防作用和直接杀灭作用，其结果的差异性可能与所用细胞有关。

3.3 不同细胞在PRRSV研究中的应用

本试验中IRPS在3D4/21/CD163细胞上的最大安全浓度与本实验室测得IRPS在Marc-145上的最大安全浓度一致，说明3D4/21/CD163作为PRRSV体外试验的靶细胞与Marc-145相比，对IRPS的耐受性相同。本试验在王学兵等[21]试验设计的基础上增加药物对病毒的直接杀灭作用，从结果看来，最佳的给药方式不相同，这两种细胞都作为PRRSV体外研究的靶细胞表现出不同的结果，推测3D4/21/CD163细胞作为改造的PAM细胞相比较Marc-145细胞可能具有更大的同源性，试验结果可能更加可靠。

PRRSV有很强的细胞嗜性，通过结合细胞受体感染宿主细胞。PRRSV在体外仅能在猪肺泡巨噬细胞(PAM)和MA-104、Marc-145、CL-2621等少数几种细胞中增殖。近年来，国内外广泛开展了中药抗PRRSV的试验研究[19]，但体外试验多用MA-104和Marc-145细胞，这2个细胞株来源于猴的肾细胞，因其为非猪源细胞[22-23]，也不属于单核-巨噬细胞系统，只限于与自然宿主相关的体外试验，因此其试验结果可能与临床实际感染差异较大。原代培养的PAM细胞在生物学和免疫病理学方面有许多优点，最接近体内病毒感染情况，但因细胞分离培养操作过程复杂，不能连续传代，成本高昂，不宜广泛应用。3D4/21是永生化的猪肺泡巨噬细胞，将PAM细胞的CD163基因克隆到真核表达载体上，然后把其转染到3D4/21(CLR-2843)细胞上，经过Zeocin抗性筛选，建立稳定表达CD163的猪肺泡巨噬细胞系[24]。将此细胞用于抗PRRSV药物筛选的体外模型细胞，其试验结果更接近PAM细胞，又比PAM细胞方便易得，其结果可能对后续的临床应用提供更可靠的理论指导。

本试验发现板蓝根多糖体外对PRRSV具有很好的预防和直接杀灭作用，其主要是作用于病毒的入侵环节，为后续研究其抗PRRSV病毒机制奠定了基础。