羊口疮病毒主要基因组编码蛋白及其功能

张孟然，丛 潇，顾月月，刘少冰，刘欣超，李文超，顾有方*

(1.动物营养调控与健康安徽省重点实验室，安徽凤阳 233100；2.安徽科技学院动物科学学院，安徽凤阳 233100)

羊口疮(Orf)学名传染性脓疱(Contagious ecthyma dermatitis)，是由羊口疮病毒(Orf virus，ORFV)或称传染性脓疱病毒(Contagious ecthyma virus，CEV)引起的一种接触性传染病，别名传染性脓疱皮炎(Contagious pustular dermatitis)等。绵羊和山羊为主要感染动物，人、猫、狗、骆驼等也可成为易感动物。

ORFV入侵易感动物无毛处和毛发较少的皮肤上皮细胞。被感染动物的唇部、眼部、舌头以及口腔内部黏膜出现大小不等的水疱、脓疱和丘疹，最后结痂痊愈。该病的临床症状与口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)、羊痘(Variola ovina)和小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)等疾病相似。成年羊群中，ORFV的感染率可高达100%，但致死率只有3%，而羔羊感染后病死率接近100%[1]。成年患病羊可以自愈，但会重复感染。目前没有治疗和预防羊口疮的特效药，主要通过接种灭活疫苗来控制疾病的传播。

1 ORF的流行病学

ORFV易感动物是绵羊和山羊，主要影响羔羊。易感动物经过接触患病动物或患病动物使用过的物品被感染。成年动物感染ORFV高达90%以上，病死率较低。幼龄动物的病死率几乎达到100%。

ORFV也可以感染猫、犬、骆驼等多种动物，在一定条件下会传染给人，主要人群为牧羊人、农民、剪羊毛工人、屠宰场工人和兽医[15-18]等与羊密切接触的行业。当相关人员的手部有伤口时，没有及时防范，接触携带ORFV的动物、肉类或人后被感染。ORF呈世界性分布，土耳其、约旦、伊朗、法国、比利时、美国和沙特阿拉伯等国家和地区每年都会暴发[19-21]。

2 ORF的病原学特点

羊口疮病毒(Orf virus，ORFV)属于痘病毒科(Poxviridae)、副痘病毒属(Parapoxvirus)中的一员，病毒颗粒呈卵圆形，大小约为 260 nm×160 nm，相比于其他痘病毒粒子较小。在电镜下观察，可见病毒粒子呈螺旋形，纵横交错排列。

2.1 基因组序列结构

ORFV是由长为130 kb～160 kb的线性双链DNA构成，G+C的含量高达64%。ORFV包含134个预测开放阅读框(opening reading frames，ORFs)，分为中央核心区(ORFs009-111)和末端区(ORFs001-008，ORFs112-134)，核心区的基因相对保守，主要功能是调控病毒的复制、包装和输出；末端区域是由两个反向重复序列(inverted terminal repeat structure，ITRs)构成，主要与病毒的致病性以及免疫调节有关，具有高度的变异性[2]。

2.2 部分基因及功能

ORFV基因组包含134个基因，一些基因编码的蛋白功能已被研究，但仍有一些蛋白的功能有待进一步研究。核心区(ORFs009-111)将ORFV基因组分为了两个末端区(ORFs001-008，ORFs112-134)，两个末端区的基因序列反向重复。

2.2.1 ORFV011基因 ORFV011 基因也称为B2L基因，长为1137bp，编码 379个氨基酸。该基因位于基因组的核心区，ORFV病毒株的B2L基因同源性较高，表明该基因较为保守，不易发生突变。B2L基因核苷酸序列同源性为 96.8%～99.7%，氨基酸序列同源性为 97%～99.2%[3]。ORFV入侵宿主细胞后，B2L基因快速进行翻译。B2L蛋白是 ORFV 囊膜的主要成分，增强病毒毒力，具有脂肪酶活性[28]。此外，B2L 蛋白也是一种棕榈酰化蛋白，刺激机体产生强烈的免疫应答反应和抗体反应，通过刺激机体的相关淋巴细胞从而分泌抗体。

2.2.2 ORFV020基因 ORFV020又称为抗性基因(interferon resistance，VIR)。ORFV入侵动物机体后，宿主的防御机制被激活来清除病毒。在病毒与宿主防御系统长时间的对抗下，ORFV进化出了一套完整的逃避宿主免疫反应的机制。机体为抵御和清除入侵的病毒，会产生干扰素(interferon，IFN)。IFN不能直接杀死病毒，而是作用于细胞表面受体上，使得细胞产生抗病毒蛋白；同时也可以增强一些免疫细胞的活力，调节免疫应答的强度，从而增强抗病毒的能力。宿主细胞在ORFV作用下会产生蛋白激酶(protein kinase，PK)，宿主细胞内的双链RNA (double-stranded RNA,dsRNA)和病毒复制中间体都可以激活蛋白激酶[26]。激活后的蛋白激酶经过一系列的化学反应后，限制病毒蛋白翻译，进而抑制病毒复制。ORFV020基因产生两种异构体，一个是较短的sh20，另一个是全长异构体，两者都可以在体外与dsRNA和蛋白激酶R (protein kinase R,PKR)结合，导致PKR失活。野生ORFV020只有在体内丧失独立的情况下，可以直接取代sh20[33]。

2.2.3 ORFV059基因 ORFV059基因大小为1 029 bp，是位于核心区的高度保守基因，也称为F1L基因，编码39ku蛋白，是ORFV的主要免疫原性蛋白，病毒感染后的中晚期进行转录。该蛋白是构成病毒表面微管不可或缺的部分，对维持病毒结构的稳定性具有重要作用，同时可以诱导机体产生免疫应答和中和抗体。该蛋白具有肝素结合活性，能够与宿主细胞表面的硫酸乙酰肝素受体相结合，此种特性对于病毒吸附以及侵入宿主细胞的能力有着重要作用[4]。

2.2.4 ORFV117基因 ORFV入侵机体后，机体快速做出免疫反应和炎症反应。ORFV117基因是一个重要的免疫调控基因，该基因编码产生的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)抑制因子(inhibitorof granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GIF)可以与宿主细胞因子GM-CSF和白介素-2(interleukin-2，IL-2)结合并抑制其生物活性[5]。GM-CSF是一个含有174个氨基酸的糖蛋白，机体中GM-CSF的存在可以促进 T 细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞的增殖活化及相关抗原的呈递[6]。IL-2 是一种源自 T 细胞的淋巴因子，可刺激 T 细胞和自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)的活化和增殖[7]。GIF在溶液中以二聚体的形式与机体的GM-CSF或以四聚体形式与机体内IL-2 相结合。ORFV 编码的GIF蛋白通过抑制白介素-2和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的功能来阻止白细胞和树突细胞的激活。

2.2.5 ORFV125基因 ORFV125基因与抗细胞凋亡有关。正常的机体会将体内衰老、死亡和被病原感染的细胞及时清理，凋亡是一种程序性死亡，确保细胞的稳态，并存活在健康的环境。它对机体组织发育和体内平衡以及对包括病毒感染在内的病理信号的免疫应答起着关键作用[8-9]。凋亡一般包括两种途径，一种为“死亡配体”与细胞表面受体(cell surface receptor)结合导致的凋亡，另一种是由于各种信号传导给线粒体后引起的凋亡。凋亡会导致半胱天冬氨酸的活化与释放。线粒体途径主要是由于线粒体外膜的透化，促凋亡因子(如细胞色素C)从膜内释放到细胞质中，线粒体的完整性受B细胞淋巴瘤基因-2 (B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白质家族成员的调节[10-11]。凋亡前的Bcl-2相关成员与线粒体膜相互作用，诱导蛋白质释放，而抗凋亡的则抑制其凋亡前体的活性。ORFV125 基因编码的蛋白与 Bcl-2 抗凋亡因子的结构相似，通过抑制Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)和Bcl-2同源拮抗剂(Bcl-2 homologous antagonist/killer,Bak)凋亡的激活，因此可以发挥抗宿主细胞凋亡的功能。

表1 已知蛋白功能的主要ORFV基因Table 1 Main ORFV genes with known protein functions

2.2.6 ORFV127基因 ORFV127基因长度为558bp，位于基因组的核心区，各不同病毒株之间的同源性较高。研究发现，ORFV127所编码的多肽与哺乳动物白细胞介素-10(IL-10)和病毒编码的疱疹病毒IL-10具有显著同源性[27]。IL-10是一种多功能细胞因子，对多种细胞发挥免疫刺激或免疫抑制作用，也是一种有效的抗炎细胞因子，对非特异性免疫功能有抑制作用，尤其是对巨噬细胞功能和Th1效应功能有抑制作用。其中抑制Th1效应是由于抑制抗原递呈细胞(树突状细胞)的成熟和功能而得到的。Fleming[12]等的研究表明，ORFV IL-10刺激小鼠的胸腺细胞增殖，抑制脂多糖激活的绵羊巨噬细胞、外周血单核细胞和角质形成细胞的细胞因子合成。IL-10活性与ORFV IL-10的研究表明，IL-10在免疫逃避中起到重要作用。

2.2.7 ORFV132基因 ORFV感染会引起皮肤的增生性病变，其中广泛的血管增生和扩张是典型的组织学特征，此感染表型可能与病毒编码的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等相关因子有关[25]。ORFV血管内皮生长因子是由ORFV132基因编码的病毒早期表达的毒力因子之一，在不同的毒株中 VEGF 基因有较大的差异。VEGF是血管内皮细胞特有的促分裂原，是血管通透性的强力诱导剂，而且它在新血管的形成中也起着至关重要的作用[13]。ORFV侵染宿主细胞后，病毒在宿主细胞内编码合成血管内皮生长因子，该因子可以刺激血管内皮增生及血管通透性的增加，为病毒粒子进一步的侵入与复制奠定基础。

3 ORFV的主要毒力因子

ORFV通过破损皮肤入侵易感动物的上皮细胞，在宿主细胞内进行生物合成。宿主和病毒相互作用的过程中，病毒不断地进化，使自身毒力和免疫原性增加，获得逃避宿主清除病毒的能力。

ORFV的毒力因子主要包括病毒血管内皮生长因子、ORFV白介素-10、绵羊干扰素抗性蛋白(ovine interferon resistance protein，OVIFNR)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子抑制因子和趋化因子结合蛋白等几种抗炎性蛋白。

病毒血管内皮因子刺激血管生成和表皮增殖，为病毒复制提供了底物，趋化因子结合蛋白通过抑制单核细胞趋化蛋白-1、巨噬细胞炎性蛋白-1a等多种趋化因子抑制免疫细胞的运转，并在激活的同时调节正常T细胞的表达和分泌。ORFV白介素-10通过抑制宿主细胞因子INF-γ、IL-10和肿瘤坏死因子-α的转录抑制炎症反应和适应性反应。GIF结合并抑制T细胞和巨噬细胞产生的GM-CSF和T细胞产生IL-2。绵羊干扰素抗性蛋白的主要功能是抗病毒，抑制IFN[14]。

4 ORF的临床症状

ORFV是一种嗜上皮病毒，由于上皮屏障完整性的丧失，角质化皮肤和粘膜表面受致病力较高的ORFV感染。一旦易感动物的皮肤擦伤或受损，ORFV就会乘机而入。临床症状常表现为唇部、眼部、舌头以及口腔内部黏膜会有大小不等的水疱、脓疱和丘疹，最后结痂。病灶只会在无毛处和少毛处，不会形成全身性扩散，不具有系统性病变。疾病的潜伏期6 d～8 d，是一种急性感染，病程通常为3周～4周[22]。

5 ORF的诊断

羊口疮与口蹄疫、羊痘和小反刍兽疫等临床症状十分相似，因此会发生误诊，影响疾病的治疗和预防。分子生物学方法可更加精准地检测出该病毒。

目前，检测ORFV感染的方法有病毒的分离、电子显微镜观察、血清中和试验、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)以及常规和实时荧光定量PCR等[29]。Wang等[30]通过比较新生牛睾丸支持细胞系、原代牛睾丸细胞和牛肾细胞对ORFV的敏感性，表明新生牛睾丸支持细胞的敏感性更高。Xu等[31]建立了多重TaqMan PCR，可以在临床上同时鉴别和检测山羊和绵羊病毒样本中小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒、山羊痘病毒和羊传染性脓疱病毒。Wang等[32]建立了重组酶辅助扩增(recombinase aided amplification,RAA)快速检测ORFV的方法。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)可在等温条件下扩增DNA序列诊断该病[19，22]。与其他基于核酸检测方法相比，其优点是更简单、快速、廉价。印度开发出了一种在单管反应中可以同时检测和区分羊痘、山羊痘和羊口疮病毒的多重PCR方法。在不断的研究中还研发出了一种基于RNA聚合酶基因序列的数字液滴PCR检测ORFV的方法[16，22]。

6 ORFV的防控

由于该病通常在感染后的6周～8周就会自行消失，对患病动物只需进行保守治疗即可。在患病动物感染部位使用局部的防腐剂预防继发性感染。民间有很多不同的治疗方法，如刮除术、冷疗法、电烙术、咪奎莫特和西多韦弗[14,23-24]。

目前，还没有普遍认可的有效预防绵羊和山羊ORFV的疫苗。现有的ORFV疫苗是基于患病动物脱落的结痂或是在培养物中培养出的病毒而研制的。疫苗可以限制ORF的严重程度和感染时间，但是不能使易感动物获得持久的主动免疫，因此接种过疫苗的动物仍会重复感染[16,22]。

ORFV也可以作为重组疫苗载体在宿主中表达外源基因具有潜在的应用前景[16]。ORFV作为载体具有的优点为病变只局限在皮肤，不会全身性传播。

7 展望

ORFV研究的最新进展对病毒的致病机制、病毒的进化和制作免疫调节剂的价值有了新的认识。ORFV中参与病毒复制、免疫抑制和血管生成的多个基因已经被研究，但是仍有部分ORFV基因的功能尚不清楚。对ORFV的进一步研究可以揭示功能不清的基因，并为人们提供更多关于病毒进化的认识。对ORFV免疫逃避的研究可以为开发出新型ORFV疫苗和防控措施，降低ORF对养殖业和经济发展的损失。