一起大熊猫感染犬瘟热的诊断

张丹辉，马军权，沈洁娜，刘宝

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.秦岭大熊猫研究中心(陕西省珍稀野生动物救护基地)，陕西周至 710402)

犬瘟热(Canine distemper)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)引起的一种急性、烈性传染病，俗称犬瘟。主要临床症状为胃肠炎、肺炎、双相热和严重的神经症状。本病对犬的致死率高达60%以上，严重危害犬类、大熊猫[1]、小熊猫等动物的健康。人类和其他动物对此病无易感性，但会通过接触传播病毒。

本病主要通过飞沫和接触途径传播，在发病早期阶段，患病动物眼、鼻腔浆液性分泌物中含有大量的犬瘟热病毒，同时尿液和粪便中也含有病毒[2-3]，容易通过污染物传播。在许多动物园，大熊猫繁育基地也出现了犬瘟热病毒的感染，危害极大。犬瘟热病毒为泛嗜性病毒，对上皮细胞和淋巴细胞有特殊亲和力，因而病变的分布非常广泛。大熊猫感染犬瘟热病毒后会出现不同程度的呼吸系统、消化系统及神经系统症状，其中神经系统症状表现最为明显。犬瘟热的临床症状复杂，表现多样，容易与细小病毒病、流感、胃肠炎等混淆。

2015年，原陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心圈养的大熊猫突发犬瘟热疫情，6只大熊猫感染，其中5只临床发病个体死亡。本试验通过临床症状分析[4]、快速检测卡检测、病理剖检[5-6]，并结合犬瘟热病毒实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测，综合诊断分析患病大熊猫感染了犬瘟热病毒[7]。犬瘟热不仅严重威胁着圈养大熊猫种群的健康，同时也易引发兽医公共卫生学问题[8-9]。通过此次对大熊猫犬瘟热的诊断分析，为以后大熊猫犬瘟热的诊断提供临床依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集 无菌棉签采集大熊猫眼部和口鼻分泌物16份，患病大熊猫6份，健康大熊猫10份。患病大熊猫编号1～6，健康大熊猫编号7～16。采集大熊猫的血液样品放入2 mL离心管中，每管中加300 μL DMEM(加双抗，双抗浓度为8 000 IU/500 mL～10 000 IU/500 mL)，涡旋振荡30 s，4℃、8 000 r/min离心5 min。将大熊猫抗凝全血样品取500 μL加等量的Solution R1，振荡混合30 s，室温静置1 min，放入1.5 mL离心管中。

1.1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒，赛默飞世尔中国有限公司产品；犬瘟热病毒通用型实时荧光定量PCR检测试剂盒，上海雅吉生物科技有限公司产品；DNA Marker DL 2 000、Trizol，Takara公司产品；犬瘟热病毒检测试纸，韩国安捷公司产品；异丙醇、750 mL/L乙醇等常用分子试剂，天津市科密欧化学试剂有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 移液器(Eppendorf Reference® 2)，艾本德(上海)国际贸易有限公司产品；超速离心机(Eppendorf 5420)，艾本德(上海)国际贸易有限公司产品；实时荧光定量PCR仪(伯乐T100)，伯乐生命医学产品(上海)有限公司产品；核酸蛋白质检测仪 (DU800)，美国BECKMAN公司产品；纯水仪(ELIX5)，美国Millipore公司产品；超低温冰箱(MDF-U5412)，日本SANYO公司产品；涡旋混合器(DH-300)，杭州瑞诚仪器有限公司产品；恒温培养箱(FormaTM3103913)，赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品；冰箱(BCD-521WDPW)，海尔集团产品；恒温水浴锅(HH-W420)，常州市亿能实验仪器厂产品；生物安全柜(SX-BHC)，苏州苏信环境科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 快速检测试纸测试 分别用无菌棉签收集1～16号大熊猫眼部周围分泌物，口鼻分泌物，在稀释液中稀释后，在被检物窗口上滴2～3滴，过5 min～10 min后判断检测结果。

1.2.2 病理组织切片、剖检 对死亡大熊猫进行体表检查，观察其皮肤被毛、天然孔、可视黏膜等状况，记录拍照。病理剖检死亡大熊猫，依次观察腹腔、盆腔、胸腔、口腔、颅腔和脑及各器官病变拍照并取材，选取有典型病变的部位采集1cm3～2cm3的小块，放置于40 g/L甲醛溶液中固定，脱水，石蜡包埋，HE染色，光学显微镜下观察拍照。

1.2.3 犬瘟热病毒实时荧光检测 在非麻醉状态下，从大熊猫前臂腕关节处静脉无菌采集外周血，提取RNA。按照犬瘟热病毒通用型实时荧光定量PCR检测试剂盒使用方法进行检测。由Primer5.0设计应用针对犬瘟热病毒N基因的引物。上游引物CDVF-477：5′-GTGACTGCTCCTGATACTGC-3′；下游引物CDVR-477：5′-ACCAACTCCCATAGCATAAC-3′，并由博仕基因合成。PCR反应条件为：反转录，42℃ 10 min；预变性，95℃ 3 min；预扩增95℃ 5 s，55℃ 40 s，5个循环；PCR扩增95℃ 5 s，55℃ 40 s，40个循环(此阶段结束采集荧光信号)。

2 结果

2.1 犬瘟热快速检测试纸

采集健康大熊猫10只和患病大熊猫6只眼角、口鼻分泌物，经过犬瘟热(CDV)快速检测试纸检测，6只患病大熊猫结果均为阳性，10只健康大熊猫检测结果均为阴性，初步判断患病大熊猫感染犬瘟热病毒。

2.2 大体病理学变化

病死大熊猫剖检后可见掌面开裂，肉垫增厚(图1A)；鼻子过度角质化，鼻镜干裂增厚(图1B)；皮下淋巴结肿大(图1C)；胆囊萎缩，胆汁黏稠(图1D)；肠系膜淋巴结水肿。脾脏肿大呈深褐色，切面质脆，渗出泡沫样褐色液体(图1F)；肺脏淤血、出血和切面呈大理石样花纹，肺脏间质增宽，可见针尖大小出血点。气管和肺泡腔内有泡沫状黏液渗出(图1E)；脾头部位肿大，切面外翻，脾头边缘可见小的梗死灶(图1F)；肝脏、心脏肿大，心血管梗死(图1G)；肠道黏膜脱落严重、出血；脑血管和脑硬膜充血水肿，一侧脑组织明显淤血和出血点，脑室轻度积液(图1H)。

A.掌面开裂，肉垫增厚；B.鼻镜干裂；C.皮下淋巴结肿大；D.胆囊萎缩，胆汁黏稠；E.肺脏淤血、出血；F.脾脏肿大，有梗死灶；G.心脏肿大，血管梗死；H.脑组织淤血，有出血点。A.The palmar surface is cracked and the claw pad is thickened；B.Cracked nose；C.Subcutaneous lymphadenopathy；D.Gallbladder atrophy,thick bile；E.Lung congestion with bleeding spots；F.Splenomegaly with infarct；G.Heart enlargement,vascular infarction；H.Congestion of brain tissue with bleeding spots.图1 病死大熊猫大体病理学变化Fig.1 General pathological lesions of the dead giant panda

2.3 病理组织学变化

肺脏小血管和肺泡壁毛细血管淤血，肺泡腔内浆液渗出(图2B)，细支气管上皮脱落(图2D)；大脑皮层神经细胞可见白质空泡化，核内可见嗜酸性包涵体，小胶质细胞增生(图2E1、图2E2和图2F)；脾脏淋巴细胞明显减少(图2G和图2H)。

A、B、C.小血管和肺泡壁毛细血管淤血，肺泡腔内浆液渗出；D.细支气管上皮脱落；E1.白质空泡化；E2.小胶质细胞增生；F.核内嗜酸性包涵体；G、H.淋巴细胞明显减少。A,B,C.Congestion of small blood vessels and capillaries in the alveolar wall,exudation of serous fluid in the alveolar cavity;D.Bronchiolar epithelial shedding;E1.White matter vacuolation;E2.microglia proliferation;F.Nucleus eosinophilic inclusion bodies;G,H.Lymph The cells are significantly reduced.图2 病死大熊猫病理组织学观察Fig.2 Histopathological observation of dead giant pandas

2.4 犬瘟热病毒实时荧光定量PCR检测

经犬瘟热病毒实时荧光定量PCR检测，样本检测结果1～6号和阳性对照(cycle threshold)Ct值小于37，结果表明1～6号大熊猫犬瘟热病毒核酸阳性，7～16号样本检测均为阴性。其中，实时荧光定量PCR检测中Ct值≥37，判定为阴性，undetermined判定为阴性。

表1 检测结果Table 1 Test results

3 讨论

犬瘟热是由犬瘟热病毒引起的犬科、鼬科、大熊猫科等多种动物急性接触性传染病。大熊猫也可感染此病，犬瘟热对大熊猫迁地保护工作的危害极大，是引起大熊猫死亡的头号杀手[10]。

大熊猫犬瘟热可引起大熊猫鼻镜干裂，排出脓性鼻液。食欲减退或废绝，呕吐。发病后期大熊猫突发全身剧烈抽搐、震颤，牙齿咬合困难，口吐白沫，肌肉阵挛等症状。大体病理学变化可见大熊猫肺泡毛细血管淤血，细支气管上皮脱落；脾脏淋巴细胞数量减少，大脑皮层神经细胞可见嗜酸性包涵体，符合犬瘟热病毒的临床症状及病理学特征。通过犬瘟热快速检测卡和犬瘟热病毒实时荧光定量PCR检测后，可以确定为犬瘟热病毒感染。

发生犬瘟热后，中心迅速采取了隔离措施，将健康的大熊猫进行分散转移，一人一大熊猫进行隔离饲养，并进行犬瘟热疫苗接种，疫苗为基因重组苗(Purevax®Ferret Distempe)；另一方面成立救治组，对患病大熊猫进行救治，但效果不佳，最终感染的6只大熊猫5只死亡，1只转阴康复。犬瘟热发病具有明显的季节性，特别是冬春时节易发。在患病大熊猫活动场发现有死亡的野猫，分析本次大熊猫发病的原因是由于野猫携带犬瘟热病毒造成大熊猫感染。

由于大熊猫本身数量稀少，且对于大熊猫相关疾病的研究较少。目前，还没有专门针对大熊猫病毒性传染病的疫苗。因此，还需要加大科研攻关，早日研发出适合大熊猫使用的疫苗。大熊猫犬瘟热主要有传染性高，传播迅速，并发症复杂，诊治困难，死亡率高等特点。统计分析历年发生大熊猫感染犬瘟热的病例发现，大熊猫一旦感染犬瘟热病毒并出现临床症状，病死率高达95%以上，基本无从治愈。因此，做好大熊猫日常饲养管理工作和消毒防控措施，显得尤为重要[11]。一方面加强大熊猫体能的锻炼和营养的补充，增强大熊猫机体的抗病能力。另一方面做好消毒防控措施，定期对大熊猫饲养区域进行消毒杀菌；联合地方政府对饲养区周边5 km范围内的猫犬进行犬瘟热和细小病毒二联疫苗免疫，建立保护隔离带。