基于Wnt/β-catenin信号通路探讨血府逐瘀汤在非小细胞肺癌EGFR-TKI获得性耐药中的作用

王理槐，孙银辉，张领兄，刘 欢，周 琴，袁苏云，张亚茹，朱 乐，张 红

(1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；3.重庆市九龙坡区中医院，重庆 400051)

我国肺癌的发病率和病死率近年来不断升高，已位居所有恶性肿瘤的首位，其中又以非小细胞肺癌(Non-small cell lung carcinoma,NSCLC)为其主要类型，多数NSCLC患者确诊即为晚期，治疗棘手，5年生存率较低[1-2]。以厄洛替尼为代表的表皮生长因子(Epidermal growth factor receptor,EGFR)-酪氨酸酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitor,TKI)分子靶向药物的出现则为NSCLC的治疗带来了重大突破，然而耐药性的产生使得TKI的靶向治疗极为受限，而EGFR的突变导致Wnt/β-catenin信号通路的激活是引起NSCLC患者对TKI敏感性降低的重要机制之一[3-5]。众多研究[6-7]表明，对NSCLC患者采取EGFR-TKI与中医药的联合治疗可有效控制疾病进展，获得较长的无进展生存期，笔者在对临床病例的观察中亦发现，该疗效的产生或与中医药可延缓NSCLC患者对TKI耐药的产生有关。中医认为久病成瘀，各类恶性肿瘤的始终皆与瘀血密切相关，活血化瘀当是其治疗各类肿瘤的基本治则之一，血府逐瘀汤也已广泛用于各类肿瘤的治疗，疗效较佳[8]。本研究拟从动物实验探讨血府逐瘀汤对NSCLC获得性耐药的疗效，及其是否可调控Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白进而延缓或抑制厄洛替尼耐药性的产生，以期为临床中医药抑制靶向治疗NSCLC耐药提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：Balb/c小鼠50只雌雄各半(其中10只以防小鼠意外死亡备用)，SPF级，体重18～22 g，8～10周龄，于湖南斯莱克景达实验动物有限公司购买，均按清洁级标准饲养于湖南中医药大学实验中心，室温25 ℃，自由饮食和进水。动物的使用均根据我校《实验动物管理规定》实施。

1.1.2 药物：盐酸厄洛替尼片(上海罗氏制药有限公司，国药准字J20170030，规格1.5 g/片)；血府逐瘀汤：桃仁12 g，红花、当归、生地、牛膝各9 g，川芎、桔梗各5 g，赤芍、枳壳各6 g，柴胡、甘草各3 g，由湖南中医药大学校医院药剂科提供，经煎药机煮成汤剂，60 ℃分别浓缩成含生药15 mg/ml(低剂量)、45 mg/ml(高剂量)，4 ℃储备存用。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞来源：将对厄洛替尼获得性耐药的NSCLC细胞株PC9/ER(购于上海传秋生物科技有限公司)置于RPMI 1640培养基(10%胎牛血清、1%青链霉素)中传代培养，传代至足够数量后，采用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，并取少量悬液台盼蓝染色鉴定活细胞含量超过95%，最后离心去上清，以无血清的DMEM培养液调制浓度为2×107个/ml PC9/ER细胞悬液备用。

1.2.2 动物造模及给药：将调制的PC9/ER细胞悬液接种于所有裸鼠左侧腋部皮下，每只接种2点，每点0.2 ml。待2周后，所有小鼠均成瘤，肿瘤体积均达150～250 mm3，从中选取肿瘤体积较均匀的40只裸鼠，随机分为五组，每组8只。空白组：给予0.9%氯化钠溶液(0.4 ml/只)灌胃；TKI组：给予厄洛替尼30 mg/(kg·d)灌胃给药；低剂量组：以15 mg/ml低剂量血府逐瘀汤按30 ml/(kg·d)灌胃给药；高剂量组：以45 mg/(kg·d)血府逐瘀汤按30 ml/(kg·d)灌胃给药；高剂量+TKI组：45 mg/ml血府逐瘀汤按30 ml/(kg·d)标准并联合厄洛替尼30 mg/(kg·d)标准灌胃给药。所有组别均为每天给药1次，共给药20 d。于第20天给药后称重后处死所有裸鼠，并剥离移植瘤。

1.2.3 观察指标：①瘤体体积：给药前及给药后每4 d测量瘤体最长径(a)和最短径(b)，并根据公式V=πab2/6(mm3)算出瘤体体积。②生长抑制率：依据瘤体体积大小绘制肿瘤的生长曲线图，计算肿瘤的生长抑制率(TWI%)=(C-T)/C×100%，C为空白组小鼠平均体积、T为给药组小鼠体积。③肿瘤细胞增殖指数：将石蜡处理后的瘤体样本以4 μm厚度切片，并进行免疫组织化学和HE染色，每张切片以显微镜随机选择5个高倍视野，对Ki67阳性细胞和总细胞数进行计数，并计算Ki67指数=Ki67阳性细胞数/总细胞数×100%。Ki67指数越高表明肿瘤生长越快，组织分化能力越差。④Wnt3α、P-GSK3β与β-catenin的蛋白表达：用Western blot法检测，将冷冻肿瘤组织在液氮中迅速研磨成粉末，加入细胞裂解液(含蛋白酶和磷酸酶抑制剂)，冰上裂解后于4 ℃ 12000 g离心15 min，取上清液，应用BCA分析试剂测定蛋白浓度，50 μg蛋白质在SDS-PAGE 电泳分离，半干法转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗4 ℃过夜，TBST洗膜3次，加入二抗室温孵育2 h，TBST洗膜3次，加入ECL发光液暗室中显影，图像扫描，以GAPDH蛋白的表达为内参照，应用凝胶图像软件分析目标条带灰度值。

1.4 统计学方法 应用SPSS 22.0统计学软件处理，计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组瘤体体积比较 见表1。在给药第16天、第20天时，高剂量+TKI组瘤体体积小于空白组及TKI组，给药第20天，高剂量组瘤体体积小于空白组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组瘤体体积比较(mm3)

2.2 各组瘤体生长抑制率比较 见表2。在给药第16天、第20天时，高剂量+TKI组瘤体生长抑制率高于TKI组、高剂量组，给药第20天，高剂量组瘤体生长抑制率高于TKI组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组瘤体生长抑制率比较(%)

2.3 各组肿瘤细胞增殖Ki67指数比较 见表3。空白组、TKI组、低剂量组肿瘤细胞增殖Ki67指数比较差异无统计学意义(P>0.05)；高剂量组、高剂量+TKI组肿瘤增殖Ki67指数均低于空白组，高剂量+TKI组肿瘤增殖Ki67指数低于高剂量组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组肿瘤细胞增殖Ki67指数比较

2.4 各组Wnt3α、P-GSK3β与β-catenin的蛋白表达情况 空白组、TKI组、低剂量组Wnt3α、P-GSK3β与β-catenin的蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)；高剂量组、高剂量+TKI组Wnt3α、β-catenin蛋白表达均低于空白组，P-GSK3β蛋白表达均高于空白组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

注：与空白组比较，*P<0.05图1 血府逐瘀汤对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响

3 讨 论

对于NSCLC的治疗，EGFR-TKI获得性耐药的定义为曾接受过厄洛替尼等TKI药物的治疗并按WHO标准取得了确实的临床疗效一段时间后肿瘤又继续进展[9]。因此，由于对晚期NSCLC有效治疗手段的相对匮乏，相较于原发性耐药，解决获得性耐药TKI治疗敏感性问题，延长其临床获益时间，对于该类NSCLC患者具有重要临床意义，可有效提高其5年生存率及生活质量。NSCLC属于中医学“癥瘕”“积聚”等范畴，多数医家皆认为血瘀是“癥瘕”发生发展的主要病理基础，如《血证论》中有云：“瘀血在经络脏腑，则结留瘾，气为血滞，故聚而成形”[10]。现代医学亦佐证，血液流变学的异常和微循环障碍在各类肿瘤中普遍存在，血液高黏、微循环灌注不足，血管内皮功能受损，继而异形血管大幅增生，使肿瘤细胞有更多机会接触血管，并分泌细胞因子加速异形血管的增生，从而促进自身生长，并形成癌栓转移，可见血瘀证是贯穿各类恶性肿瘤始终的重要病理基础[11-12]。血府逐瘀汤是活血化瘀法治疗血瘀证的代表方，同时兼具行气止痛之功，由桃仁、红花、当归、生地等药组成，其在各类恶性肿瘤的治疗中均有一定应用，笔者运用其治疗肺癌已有多年，该方对于厄洛替尼治疗NSCLC具有较好的协同作用，疗效较佳，因此笔者思考其取得较好协同作用的机制之一是否为提升NSCLC对EGFR-TKI的敏感性，延长患者厄洛替尼的临床获益时间。

本实验结果显示，在给药第16天时高剂量+TKI组瘤体体积、瘤体生长抑制率指标的改善均优于其他各组，其他各组间则无明显差异，在给药第20天时，高剂量+TKI组两项指标的改善同样最优，而高剂量组相较于空白组亦有了一定改善，其他各组则无明显差异。表明高剂量的血府逐瘀汤对于获得性耐药NSCLC的治疗具有一定疗效，但其与TKI连用时，可提高获得性耐药NSCLC对EGFR-TKI的敏感性，进而获得更佳效果，明显优于单一使用，而低剂量的血府逐瘀汤则无明显疗效，肿瘤细胞增殖Ki67指数高剂量组+TKI组最优，高剂量组其次，剩余各组则无明显差别亦可佐证以上观点。血府逐瘀汤中桃仁、红花、川芎等药破血祛瘀以止痛，牛膝引血下行，使中、上焦之瘀滞化有去路，生地、当归则养血益阴，以达瘀血去、新血生之效，气为血之帅，故再加桔梗、枳壳、柴胡宽胸理气，以助血行并防血瘀所致之气滞，同时桔梗可载药上行，使药效直达病位，全方活血行气并行，祛瘀养血同施，故可有效治疗血瘀所致诸症[13]。现代药理研究[14-15]也表明，该方具有抑制血小板聚集、扩张微血管、促进血液流动等效果，进而可明显改善全身血液循环障碍，同时当归、柴胡、牛膝等药还能促进TB淋巴细胞的活化，调节机体免疫应答，进而发挥抑瘤作用，并起到了提高EFGR对TKI敏感性的效果。此外，血府逐瘀汤发挥其抗肿瘤效果和改善EGFR-TKI耐药作用与时间及剂量具有一定相关性，肿瘤的血瘀证表现为全身性微循环障碍，往往需要一定的治疗时间及较高剂量才可取得一定疗效，本实验中指标的改善均在给药16 d后才有明显差别。

Wnt/β-catenin信号通路参与多种疾病的发生发展，同时对包括NSCLC的多类恶性肿瘤的增殖、转移均具有调控作用，在NSCLC细胞中具有较高活性，该信号通路主要包括Wnt3α、P-GSK3β、β-catenin蛋白等[16]。EGFR突变导致的其对TKI敏感性降低50%是由于其外显子中第790号氨基酸位点(T790M)的突变形，已有研究[17-18]证实发生T790M突变的患者中β-catenin存在明显的异常激活及表达，而敲低β-catenin可明显提高非敏感的肺癌细胞对TKI的敏感性，故而调控Wnt/β-catenin信号通路的异常是改善EGFR-TKI获得性耐药及抑制NSCLC病情进展的有效途径之一。正常情况下，Wnt/β-catenin通路为静息状态，Wnt3α低表达，仅极为稀少的β-catenin在细胞膜上表达，P-GSK3β为该通路的负相调控蛋白，多数胞质内的β-catenin可被P-GSK3β形成的复合物磷酸化降解[19]。而NSCLC患者的肺癌细胞可受到刺激信号，Wnt3α等蛋白表达激活，并于Frizzled家族受体结合，使散乱蛋白聚集于胞膜处磷酸化P-GSK3β，阻止其复合物的形成，进而稳定并促进β-catenin蛋白的表达，而作为该信号通路激活的核心因子，大量聚集的β-catenin可与核内转录因子T细胞因子结合，从而激活下游靶基因的转录，最终促进肺癌细胞的增殖、浸润和转移，并诱导TKI获得性耐药的产生[20]。本实验结果表明高剂量组、高剂量+TKI组Wnt3α、β-catenin蛋白表达均低于空白组，P-GSK3β蛋白表达均高于空白组，剩余各组则无明显差别，提示高剂量的血府逐瘀汤可下调NSCLC患者Wnt3α的异常表达，上调P-GSK3β表达，恢复其复合物对β-catenin的正常降解功能，进而抑制Wnt/β-catenin信号通路的过度激活，发挥抗肿瘤及改善TKI获得性耐药的作用。

综上，高剂量血府逐瘀汤可抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，通过下调Wnt3α、β-catenin蛋白表达，上调P-GSK3β蛋白表达来延缓EGFR-TKI获得性耐药NSCLC小鼠肿瘤进展，抑制腋下移植瘤体积，降低肿瘤细胞增殖指数。