不同发酵方式对铁皮石斛醋有机酸及风味特征影响的分析

徐融融，卢红梅*，吴 震，陈 莉，袁治浩

（1.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025）

铁皮石斛（Dendrobium officinale）又名黑节草、救命仙草，是一种名贵的中药材，在我国具有悠久的药用历史。铁皮石斛含有多糖、菲类、联苄类化合物、石斛碱以及酚类物质等活性成分[1]，具有重要的研究价值。现主要以温水或药酒浸泡后饮用，与此相似的还有铁皮石斛的茶类产品，这些产品通常以铁皮石斛茎、花单独或与其他原料复配，经过传统杀青、干燥等工艺制作而成[2-3]。铁皮石斛丰富的功效成分使得人们不再满足于单一的物理方式加工，人们通过将发酵技术引入，使铁皮石斛产品更加多元化，石斛汁酸奶[4]、石斛乳酸饮料[5]、石斛发酵酒[6]等产品相继被研发，这些兼具风味感官和保健功效的铁皮石斛产品也为石斛产业的发展带来了极大的动力。

食醋是一种酸性调味品，食用历史已经超过3 000年。根据原料不同可分为谷物醋、水果醋、蔬菜醋（洋葱、番茄、茶叶等）[7]，近年来，随着人们健康意识的加强及药食同源植物饮料的兴起，以葛根[8]、山药[9]、山茱萸[10]等植物为原料的功能性食醋相继被开发与研究，翟小艳[11]利用陕北甜荞麦为原料酿造高黄酮化合物的保健醋，张静等[12]以太子参为原料生产太子参醋饮料等，这些食醋具有较好的保健功效，是未来食醋行业新产品开发的重要方向。

本研究以铁皮石斛浆和大米糖化液为原料制备食醋，利用酵母菌及植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）混菌进行酒精发酵，并分别采用固、液态两种方式进行醋酸发酵，得到液态单菌发酵铁皮石斛醋、液态混菌发酵铁皮石斛醋以及固态混菌发酵铁皮石斛醋3种醋样。通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法和气质联用（gaschromatography-massspectrometer，GC-MS）法分析3 种铁皮石斛醋样中有机酸和风味物质。通过对比3种食醋样品液体发酵和固态发酵铁皮石斛醋的理化指标、风味物质和有机酸成分组成，确定铁皮石斛醋的最佳发酵方式，为铁皮石斛食醋的产业化开发奠定基础。开发药食同源植物铁皮石斛的食醋产品，既能更好地发挥醋的保健功效，又能为铁皮石斛产品多元化发展提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料与菌株

铁皮石斛茎、叶：贵州省黔西南布依族苗族自治州安龙县某石斛种植基地；活性干酵母SY：湖北安琪酵母股份有限公司；巴氏醋酸菌（Acetobacter pasteurianus）GDMCC 1.158、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）GDMCC 1.191：广东省微生物菌种保藏中心。

1.1.2 试剂

葡萄糖（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯）：天津市富宇精细化工有限公司；苯酚（分析纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；浓硫酸、浓盐酸（均为分析纯）：重庆川东化工（集团）有限公司；氢氧化钠（分析纯）：重庆茂业化学试剂有限公司；糖化酶（100 000 U/g）：北京索宝来科技有限公司；α-淀粉酶（4 000 U/g）：上海源叶生物科技有限公司；丙酮酸、草酸、乳酸、乙酸、苹果酸、琥珀酸（均为色谱纯）：贵州迪大生物科技有限责任公司；甲醇（色谱纯）：河北百灵威超精细材料有限公司。

1.1.3 培养基

MRS培养基：上海博微生物科技有限公司。

种子培养基[13]：1%葡萄糖，1%酵母膏，0.05%硫酸镁，0.05%磷酸二氢钾。灭菌后（121 ℃、15 min）在接种前加入体积分数3%无水乙醇。

1.2 仪器与设备

SPX-250B生化培养箱：上海琅玕实验设备有限公司；SW-CJ-1F洁净工作台：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；Agilent 1260高效液相色谱（HPLC）仪、ZORBAX SB-Aq色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：美国安捷伦公司；Pegasus BT气相色谱-质谱联用（GC-MS）仪：美国力可公司。

1.3 方法

1.3.1 铁皮石斛醋的加工工艺流程及操作要点

操作要点：

（1）菌种活化与培养

酵母菌：称取活性干酵母于含糖量为20 g/L的糖水（酵母添加量的5倍）中，在37 ℃温度下水浴15～30 min活化。

乳酸菌：将斜面保藏植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）GDMCC 1.191接种至MRS培养基在37 ℃下静置培养24 h活化后制备1级种子液，再将1级种子液以10%的接种量接种于MRS培养基37 ℃培养制备2级种子液。

醋酸菌：将斜面保藏巴氏醋酸菌（Acetobacter pasteurianus）GDMCC 1.158接种至种子培养基。在30 ℃、150 r/min条件下振荡培养48 h活化后制备1级种子液，再将1级种子液以10%的接种量接种于种子培养基，30 ℃、150 r/min培养制备2级种子液。

（2）原、辅料的制备

大米糖化液：大米淘洗后加入4倍质量的纯净水，沸水浴40 min，呈均匀浆糊状开始冷却，冷却至65 ℃加入0.2%的中温α-淀粉酶反应2 h，然后冷却至60 ℃加入0.5%糖化酶反应5 h得到大米糖化液[14]。

铁皮石斛茎浆：新鲜铁皮石斛茎清洗、沥干，切为长度为1～2 cm的小段放入破壁机，铁皮石斛与水以1∶15（g∶mL）料水比打浆后，备用。

辅料铁皮石斛叶粉：挑选无霉变、无病虫害的新鲜铁皮石斛叶，流动水清洗2次，沥干后置于60 ℃烘箱烘干、碾碎，10目过筛备用。

（3）液态法铁皮石斛醋的制备

将铁皮石斛浆加入大米糖化液，同时加入已活化的酵母和乳酸菌种子液。其中铁皮石斛浆添加量为50%，酵母菌接种量为0.1%，乳酸菌的接种量为4%。将混合体系放置于30 ℃培养箱中静置培养5 d，直至发酵液中酒精度和可溶性固形物含量变化趋于平缓视为酒精发酵结束。将酒精发酵完成后的铁皮石斛酒醪以4 000 r/min条件离心10 min取上清液，调整酒精度至8.0%vol，然后接入12%醋酸菌种子液，将发酵液置于32 ℃、160 r/min条件的摇床中发酵7 d，直至发酵液中总酸含量不再升高视为发酵结束。此时将发酵液以8 000 r/min条件离心10 min，所得上清液即为液态法铁皮石斛醋。

（4）固态法铁皮石斛醋的制备与取样

酒精发酵阶段操作同上，向发酵好的铁皮石斛酒醪中接入12%醋酸菌种子液，再加入提前准备好的铁皮石斛叶粉制醋醅，调整醋醅含水量至70%，并将醋醅用保鲜膜封好，置于32 ℃培养箱中静置发酵约14 d，每天翻拌醋醅一次，直至醋醅中总酸含量不再升高视为发酵结束。此时采用套淋法淋醋，以醋醅与水质量比为1.0∶1.2（g∶mL）加水浸泡12 h，以2层纱布过滤得到头醋，于新醋醅中以相同比例加入头醋浸泡，如此反复操作3次，最后将醋液以8 000 r/min条件离心10 min，所得上清液即为固态法铁皮石斛醋。

（5）灭菌

液态法、固态法铁皮石斛醋液样品置于恒温水浴锅中，待其中心温度达到75 ℃，灭菌15 min，得到未添加铁皮石斛液态混菌发酵米醋（RV）、液态单菌发酵铁皮石斛醋（DV1）、液态混菌发酵铁皮石斛醋（DV2）以及固态混菌发酵铁皮石斛醋（DV3）成品。

1.3.2 产品品质分析

（1）理化指标测定

总酸含量的测定：参照GB/T 5009.41—2003《食醋卫生标准的分析方法》中酸碱滴定法；不挥发酸含量的测定：参照GB18187—2000《酿造食醋》；总酚含量的测定：参照XIE X L等[15]的方法；多糖含量的测定：采用苯酚-硫酸法[16]。

（2）有机酸测定

采用高效液相色谱法对样品中的有机酸进行测定。有机酸混合标准曲线绘制[17]：选取草酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、琥珀酸标准品配成一定浓度梯度的样品混合进样，测定方法及条件同总酸的测定方法，以6种有机酸的质量浓度（x）为自变量，峰面积（y）为因变量绘制标准曲线，得到回归方程及相关系数，结果见表1。

表1 有机酸标准曲线回归方程Table 1 Standard curve regression equations of organic acids

（3）风味物质的测定

采用固相微萃取-气质联用方法对样品风味物质进行测定[18]。

样品前处理：取5.0mL样品于20mL顶空瓶中，加入20μL质量浓度为5 mg/L的2-辛醇作内标。将老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取头插入样品瓶顶空部分，于50 ℃萃取30 min，萃取完成后将萃取头取出插入气相色谱（gas chromatography，GC）进样口，于250 ℃解吸3 min，启动仪器采集数据。

GC条件：采用DB-Wax色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），载气为高纯氦气（He），GC检测器和进样口温度为250 ℃，流速：1.0 mL/min，色谱柱初温40 ℃维持3 min；然后以10 ℃/min升至230 ℃，保留5 min。

MS条件：发射电流1 mA；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃，接口温度250 ℃。

定性定量分析方法：通过色谱图上各组峰保留时间对风味成分进行定性，各种化合物定量分析采用面积归一化法。

（4）感官评价

由10名经过培训的食品相关专业人员组成评价小组，从食醋的体态、色泽、滋味、协调性方面对3种不同铁皮石斛醋样品及以未添加铁皮石斛液态混菌发酵米醋（RV）为对照进行打分[19-20]，满分100分。具体评分标准参照表2。

表2 铁皮石斛醋和米醋感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standards of Dendrobium officinale and rice vinegar

续表

1.3.3 数据处理

采用Excel 2016、Origin 8.5、SPSS Statistics 17.0等软件处理实验数据、绘制图表，实验数据均进行3次平行实验，结果以“平均值±标准差（X±S）”表示。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛醋理化指标分析

以未添加铁皮石斛的液态混菌发酵米醋（RV）为对照，3种铁皮石斛醋理化指标结果见表3。

表3 铁皮石斛醋和米醋样品理化指标的测定结果Table 3 Determination results of physicochemical indexes of Dendrobium officinale vinegar and rice vinegar samples

由表3可知，几种食醋均符合GB 2719—2018《食品安全国家标准食醋》中理化指标的要求。4种食醋的总酸含量相差不大，样品DV2相对于样品RV的总酚和多糖均有增加，说明铁皮石斛浆的加入对醋液的活性成分的展现具有一定的积极作用，这与WANG C X等[21]发现的铁皮石斛多糖能够促进糖原合成的研究结果相符，表明铁皮石斛浆调节糖代谢的功能在醋的发酵中仍然起作用；不挥发酸是衡量食醋品质的一项重要指标，用于调和食醋酸味，样品DV3的不挥发酸高于其他3种醋样，可以使铁皮石斛醋的口感更加柔和、具有回味[22]；且样品DV3与另3种醋样相比，总酚和多糖含量均为最高，其中总酚含量达到样品DV2的13倍，具有显著性差异（P＜0.05），表明固态发酵过程中填充料铁皮石斛叶的活性成分被有效地释放，这可能是由于固态发酵基质具有更加丰富的营养，有利于微生物分解底物生成更多代谢产物，同时也意味着固态法铁皮石斛醋可能具有较强的抗氧化、降血糖等功能性。

2.2 铁皮石斛醋的有机酸组成分析

以未添加铁皮石斛的液态混菌发酵米醋（RV）为对照，利用HPLC对样品DV1、DV2、DV3中有机酸的含量进行测定，结果见表4。

表4 铁皮石斛醋和米醋样品中有机酸含量测定结果Table 4 Determination results of organic acids contents in Dendrobium officinale vinegar and rice vinegar samples

由表4可知，样品DV1中未检测到丙酮酸成分或低于检测限。4种样品中有机酸组成存在较大差异，其中乙酸在各个样品中含量最高，草酸的含量相对较低。其中样品DV1和DV2中乙酸含量分别为40.71 g/L和39.18 g/L，这一结果与混合菌种发酵柑橘醋的研究结果一致[23]，样品DV1中过高的乙酸会导致较强烈的酸味，不利于食醋整体口感；样品DV2中乳酸含量达到1.64 g/L，是样品DV1的3.64倍，表明植物乳杆菌的加入能够有效提高醋液中的乳酸含量。通常食醋中最主要的挥发酸为乙酸，具有刺激性酸味，而乳酸、苹果酸、琥珀酸等不挥发酸能够有效地调和乙酸的刺激性酸味，使食醋口感更加柔和[24]。4种食醋样品中DV3的乙酸含量最低，为37.14 g/L，但其他5种有机酸含量均高于样品DV1、DV2和RV，这是由于固态发酵基质具有丰富的营养，微生物分解底物代谢产物对醋样中有机酸产生影响。相关研究证实铁皮石斛多糖是良好的益生元成分，能够促进多种益生菌生长繁殖，样品DV3中较高的乳酸可能是铁皮石斛叶中的多糖对乳酸菌代谢起到促进作用[25]。从有机酸分析来看，固态法混菌发酵铁皮石斛醋最佳。

2.3 铁皮石斛醋发酵过程中风味物质分析

以未添加铁皮石斛的混菌发酵米醋（RV）为对照，利用气相色谱-质谱联用技术分析发酵铁皮石斛醋的挥发性风味物质，各挥发性风味物质GC-MS分析总离子流色谱图见图1，各种类风味物质相对含量见图2。由图1可知，样品DV1、DV2、DV3、RV分别检测出49种、58种、75种、50种挥发性风味物质，4个样品共检出117种挥发性风味物质，主要是酸类、酯类、醇类、醛酮类、烃类及其他类。

图1 铁皮石斛醋和米醋样品中挥发性风味物质GC-MS分析总离子流色谱图Fig.1 Total ion chromatographic of volatile flavor compounds in Dendrobium officinale and rice vinegar samples analyzed by GC-MS

图2 铁皮石斛醋和米醋样品中的风味物质种类（A）及相对含量（B）Fig.2 Types (A) and relative contents (B) of flavor substances in Dendrobium officinale vinegar and rice vinegar samples

由图2可知，样品DV1和DV2均含有10种酸类物质，但是样品DV1的酸类物质相对含量明显高于样品DV2，所以单菌株发酵的铁皮石斛醋酸味可能会更加明显刺激，混菌发酵铁皮石斛醋的酸味相对柔和。样品DV2中醛酮类物质含量高于样品DV1，其中3-羟基-2-丁酮、苯甲醛等成分在样品DV2中含量较高。相关文献报道，3-羟基-2-丁酮和苯甲醛具有奶香味和杏仁味等令人愉悦的气味，这可能会使样品DV2的风味口感更优于样品DV1[26]。由样品DV2和RV的比较可知，风味物质种类增加了8种，主要为醇类和萜烯类物质，其中芳樟醇在铁皮石斛挥发性成分中被检出，具有一定的药理活性和较低的阈值，带有微甜的木青香味。样品DV3所含酸类、酯类、醛酮类物质均高于样品DV2，这表明固态发酵方式酿造的铁皮石斛醋风味物质种类更加丰富，这可能是因为固态发酵体系中固、液、气三相同时存在可为微生物提供更加适宜的生存条件，更利于产生丰富的代谢物质[7]。所以固态发酵对铁皮石斛醋的风味贡献较大[27]。

为探究4种食醋样品间风味物质组成的异同，采用VennDiagram对不同食醋风味物质的重叠情况进行了可视化处理，4种食醋样品风味物质韦恩图见图3。

由图3可知，4种食醋样品中检出20种共有风味物质，分别占DV1、DV2、DV3、RV风味物质总数的40.8%、34.5%、26.7%和40.0%，表明4种食醋的风味物质间存在一定的相似性。如果将仅出现在某一样品中的风味物质称为“特征成分”，则4种食醋样品的特征成分数量呈DV3＞DV1＞DV2＞RV的关系，可以看出特征成分数量与其各自所含风味物质种类的数量关系一致，特征成分分别为36种、15种、7种和5种，进一步说明固态发酵方式所得的铁皮石斛醋具有更加复杂的风味物质结构及风格特征，这一结果与CHIN W H等[28]的研究中一致。此外，与对照样品（RV）相比，仅出现在铁皮石斛醋样品中的风味物质有5种，分别为芳樟醇、正辛醇、α-萜品醇、3-甲基苯乙烯和1-辛醛，其中芳樟醇是存在于铁皮石斛中的药理性物质[29]，赵红等[30]研究发现，添加铁皮石斛发酵的米酒增加了芳樟醇和α-萜品醇等物质。与本文结论相符，所以推测这些仅出现于铁皮石斛醋中的成分可能均来源于铁皮石斛。

图3 铁皮石斛醋和米醋样品的风味物质韦恩图Fig.3 Venn diagram of flavor substances of Dendrobium officinale vinegar and rice vinegar samples

2.4 感官评价

以未添加铁皮石斛混菌发酵米醋（RV）为对照，对3种铁皮石斛醋样进行感官分析，结果见图4。

图4 铁皮石斛醋和米醋样品的感官评分结果Fig.4 Results of sensory evaluation of Dendrobium officinale vinegar and rice vinegar samples

由图4可知，样品DV1、DV2、DV3和RV的感官评分分别为68.0分、71.4分和80.4分和76.8分，3种不同发酵方式处理的铁皮石斛醋的体态得分均在20分以上，色泽得分较为接近，说明不同发酵方式对醋样的体态、色泽影响较小。对比样品DV1和DV2可知，混合菌种发酵能够在一定程度上改善食醋的协调性和滋味，但对食醋色泽与体态无明显影响。相较于样品DV1和DV2，样品DV3在协调性和滋味方面有较大提升，这与其所含的有机酸及风味物质种类较丰富有关，表明固态发酵方式所得铁皮石斛醋具有更能令人接受的风味口感。

3 结论

本实验以铁皮石斛浆和大米糖化液为原料通过液态单菌发酵、液态混菌发酵、固态混菌发酵方式制备食醋。分析表明，混菌发酵显著提高了乳酸含量，样品DV2所含乳酸达到1.64 g/L，是样品DV1的3.64倍，固态发酵方式明显增加了苹果酸和琥珀酸的含量，分别为2.31 g/L、1.89 g/L。3种铁皮石斛醋样品中分别检出醇类、酸类、酯类、醛酮类等，样品DV3所含酸类、酯类、醛酮类物质种类分别为14种、15种和20种均高于样品DV2，这表明固态发酵方式酿造的铁皮石斛醋风味物质种类更加丰富，且其特征成分数量（36种）均显著高于其他醋样。感官评价结果表明，样品DV3在协调性和滋味两方面明显优于样品DV1和DV2。结果表明，固态混菌发酵最利于铁皮石斛醋发酵，本研究为铁皮石斛醋的产业化开发奠定了基础。