血液GDF-15荧光免疫检测试剂盒的研究开发

刘冰　钱珊珊　李亚楠　顾敏　闫嘉

摘要：[目的]基于荧光定量免疫层析技术，开发一种生长化因子-15（（growth differentiation factor-15，GDF-15）定量检测试剂盒。[方法]以荧光微球标记偶联抗体，硝酸纤维素膜上分别包被鼠抗人GDF-15单克隆抗体和羊抗鼠多克隆抗体，抗体作为检测线和质控线制备免疫荧光试纸条，采用荧光免疫层析技术，对试剂的线性范围，最低检出限，特异性，精密性，临床诊断等方面进行系统研究。[结果]该方法的灵敏度为0.5ng/mL，线性范围为0.5-150 ng/mL，批内变异系数为9.02%-14.16%，批间变异系数为10.99%-17.71%，相对偏差小于10%。[结论]建立一种操作简便，灵敏度高，有良好准确性和重复性，线性范围较宽，能适和合临床检测的需要，用于疾病的早期筛查。

关键词：GDF-15;荧光免疫层析技术;试剂盒

GDF-15属新发血清学标志物，与多种心血管疾病诊断、预后判断等有明确相关性。GDF-15与冠脉病变程度有关，可以通过GDF-15水平评估不良血管事件风险。正常情况下，机体内GDF-15水平较低，在炎症或损伤等状态下，血清GDF-15表达水平明显升高，并参与炎症。

近年来荧光免疫层析技术快速发展，利用含有镧系稀土元素的纳米微球标记偶联抗体，结合后结构稳定，力度均一，分散性相对较好，同时能够有排除非特异性荧光的干扰，荧光寿命较长，分析灵敏度较高，该方法操作简单，环境要求较低，使用简单的仪器即可得到结果，适用于在基层医院推广使用。

1材料与方法

1.1仪器和试剂

1.2方法

1.2.1荧光微球偶合物的制备

1. 将偶联后的微球取出，在15000r/min的条件下离心15min，温度控制在4℃以下，离心结束后弃去上清液。加入一定量质量的封闭液BSA，吹打混匀，超声仪破碎，混匀后置于台式恒温振荡器中避光震荡，在37℃温度下封闭1～2h，封闭结束后，4℃以下，15000r/min，离心15-20min，去除上清液。

1.2.2抗原检测试剂的制备

（1）微球垫（结合垫）制备

将获得的荧光微球标记抗体，使用保护液对荧光微球偶联物进行稀释，稀释后使用XYZ喷金划膜仪进行喷球操作，喷球浓度，速度由实验获得，使其均匀分布于玻璃纤维微球垫之上，将喷好的荧光免疫微球垫放置于干燥箱中进行干燥，温度设置为37℃，时间为8h以上。

（2）包被垫制备

以包被缓冲液将羊抗鼠多克隆抗体和鼠抗人GDF-15单克隆抗体稀释至工作浓度配置成质控线工作液（C）和检测线工作液（T）。取稀释后的羊抗鼠多克隆抗体工作液，用划膜仪在硝酸纤维素膜上制备检测线，喷量，划膜仪平台移动速由实验获得。取鼠抗人GDF-15单克隆抗用同样的方法制备质控线，室温保持干燥。检测线和质控线在NC膜上之间的距离为5.0 ±0.1mm ，线宽约为0.8- 1.0mm，划膜前后应均匀，并置干燥箱37℃烘干，干燥保存。

（3）样品垫

使用裁条机将玻璃纤维膜裁剪为一定宽度的样品垫，将样品垫置于干净的器皿中，使用样品垫处理液对其进行浸泡，使其完全沉浸于溶液之中，浸泡一定时间后，用镊子将其取出，平铺在玻璃板上，然后将玻璃板放在干燥箱中干燥，温度设置为37℃，干燥8小时以上。

1.2.3试纸条组装

在温度15-30℃，湿度≦30%的条件下，将样品垫，微球垫，硝酸纤维素膜，吸水纸，PVC底板等物进行组装。

（1）贴荧光免疫微球垫：揭开PVC底板下方的双面胶条，取干燥后的免疫微球垫，使其与包被膜的下缘重叠1～2mm，要求材料附着牢固。

（2）贴样品垫：取干燥后的样品垫，使其下缘与PVC底板下缘对其，上缘与免疫微球垫下缘的重叠宽度为1～2mm，要求材料附着牢固。

（3）贴吸水纸：揭开PVC底板上方的双面胶条，取剪裁后的吸水纸，使其上缘与PVC底板的上缘对齐，下缘与包被膜的上缘重叠1～2mm，并压平。

（4）切条及压壳：将组装后的PVC底板放置于微电脑自动斩切机上，设置一定宽度的条宽，将其切为一定宽度的试纸条，将其放入塑料检测卡底板中（操作过程中注意不要直接接触包被膜），扣上塑料检测卡上盖，并将检测卡压紧，并与干燥剂一起放置于铝箔袋中密封储存。

1.2.4试纸条的检测

（1）原理：待测血清加入加样孔中后，血清中的抗原会和免疫微球垫上的荧光标记GDF-15抗体结合形成抗原-抗体复合物，并在硝酸纤维素膜上通过毛细作用沿着液体层析方向移动，从而被固定在T线上的包被抗体鼠抗人GDF-15单克隆抗体特异性的捕获，形成抗体-抗原-抗体复合物。此时鼠抗人抗体继续移动至C线，与其上的羊抗鼠抗体结合，使用荧光免疫层析检测仪检测，仪器会自动读取T线和C线上的荧光信号强度，由此来定量检测血液中的抗原水平。

（2）检测：在室温条件下，用移液枪吸取80μL的样品，垂直悬空缓慢加入样品垫中，反应完全后放入荧光免疫层析仪中检测，读取对应的C、T值。在紫外灯下观察，无论样品中是否还有抗原，C线都应该出现荧光条带，若C线不出现荧光条带，试纸条检测结果则判定为无效。

1.2.5样本检测

取10uL全血或者5uL血浆样本，加入到2mL的样品稀释液中，充分混匀后，取80ul混合液滴入到试剂卡样品孔中，室温下反应5min后，用时间分辨荧光免疫分析仪判读结果。

1.2.6性能评估

分别使用GDF-15内部校准品、含干扰物的样品等对试剂卡进行检测，按照《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则（征求意见稿）》及《GDF-15技术审查指导原则》评估检测系统的分析灵敏度、线性范围、精密度、准确度、特异性及其稳定性。

1.2.7统计学方法

检测数据使用SPSS17.0等统计软件进行配对卡方检验、Kappa一致性分析、线性回归和Bland- Altman等分析考核试剂的相关性、一致性。同时检测来自同一病人全血/血浆样品各40份，考核试剂卡对不同标本的检测能力。

2.结果

2.1标准曲线制作

用内部校准品进行测试，每个浓度测试10次，剔除离群值后取平均值。标准曲线线性范围为0.0-150.0 ng/mL，标准曲线具有良好的线性范围和相关性（r>0.98 ） 。

2.2分析灵敏度

以 0、0.25、0.50、1.0 ng/mL的内部标准品各测定20次，以变异系数接近20%的最低浓度作为试剂盒的分析灵敏度，结果如表1。表明该试剂盒的分析灵敏度为0.1 ng/mL。

2.3精密度

选择高（50.0ng/mL）、中（5.0ng/mL）、低 （1.0 ng/mL ）三个浓度的标准品进行精密考察，共考察了3批产品，结果如表2。表明该试剂盒的批内精密度<15%，批间精密度<20%，符合要求。

2.4特异性

选择10 ng/mL的标准品浓度，分别在里面添加如表3中的物质及其浓度，考察干扰物质对检测结果的影响，结果如表3所示。表明干扰物质对接触结果影响甚微，偏差<10%，符合要求。

3讨论

1）本试剂盒采用的主要原材料均为国产优质原材料，大幅降低了企业的生产成本，同时也能为客 户提供优质的产品。配合本公司的快速时间分辨荧光免疫分析仪使用，能为患者现场提供快速、准确的结果，特別适合中小型医疗卫生机构，方便普通民众的检测需求。

2）本试剂盒利用时间分辨荧光微球标记抗体技术，结合固相层析技术，采用双抗体夹心法原理，GDF-15单克隆抗体标记时间分辨荧光物质（荧光信号示踪），通过时间分辨荧光免疫分析仪俘获检测区域（T区）被激发的荧光信号，通过检测区域/质控区域的值与分析物的不同浓度获得定标曲线，实现人全血/血浆中的GDF-15定量检测。

3）与一般的荧光物质标记不同，该方法采用了高荧光强度的时间分辨荧光微球进行标记，通过优化标记过程的每一个细节，使检测试剂盒具有灵敏度高、检测样本用量少，检测结果快速、准确、重复性好，保存有效期长的特点。

4）本研究对试剂盒的精密度、灵敏度、线性范围和偏倚进行了分析和评估，并与进口试剂进行对比分析，两者具有良好的相关性，比较差异无统计学意义（P>0.05），能够满足临床的检验需求。

5）本研发过程采用了企业与医疗机构联合研发的模式，在确保研发质量的同时，能提高了研发效率，缩短研发周期，节省时间成本。

参考文献：

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