1株鸡传染性喉气管炎病毒的基因组特征与致病性

高 昕，罗园园，杨慧明，2，张国中，2，赵 烨*

(1.中国农业大学动物医学院，北京 100193；2.中国农业大学畜禽疫病诊断研究中心，北京 100193)

传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus, ILTV)属于疱疹病毒科，传染性喉气管炎病毒属，可引起鸡的急性、接触性上呼吸道症状。不同ILTV毒株毒力强弱有所差别。急性感染时，发病率和死亡率分别可高达100%和40%，温和型ILT发病率接近5%～10%，死亡率低于2%。病鸡主要表现为呼吸困难、咳嗽、结膜炎及咳出血样渗出物，剖检时可见喉部、气管黏膜肿胀、出血、糜烂和坏死[1]。ILTV于20世纪50年代末期首次在我国报道发生，90年代后,在我国一些地区呈地方性流行，极大地损害了我国养鸡业的健康发展[2-5]。

ILTV为线性双股DNA病毒，其基因组长度为155 kb，分为长独特区(UL)和短独特区(US)，US左侧为反向重复序列(IRS)，US右侧为末端重复序列(TRS)，IRS与TRS区序列相同但方向相反[6]。UL23(TK)、UL27(gB)和UL32基因位于UL区，TK基因是ILTV的主要毒力基因，也是构建基因缺失疫苗的主要靶标[7-8]。UL27(gB)和UL32编码病毒粒子表面糖蛋白，其中，gB是病毒感染所必需的主要糖蛋白和保护性抗原，可诱导体液免疫[9]。二者保守性高，作者前期研究表明，表达gB和UL32基因的重组鸡痘病毒疫苗具有良好安全性和稳定性[10]。ICP4基因位于IRS区域，参与激活病毒早/晚期基因的表达[11]，ICP4基因与病毒毒力存在关联。

由于ILTV具有急性暴发和长期潜伏感染的特性，需要对ILTV进行实时监控，了解当前流行毒株的基因特征及致病性对于控制ILT的流行具有重要意义。本试验对1株ILTV分离株的关键毒力基因序列TK、ICP4及免疫糖蛋白序列gB、UL32进行分析，了解其分子进化特征及在进化树中与流行毒株的亲缘关系，并开展SPF鸡的致病性研究，研究结果丰富了我国ILTV分子流行病学调查内容，为进一步开展ILTV的防控提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 病毒的繁殖与复壮

取本实验室分离保存的传染性喉气管炎病毒BT株(ILTV-BT)病毒液经绒毛尿囊膜途径(CAM)接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.2 mL，置于37 ℃温箱中培养5 d，无菌收集有明显病变的绒毛尿囊膜，无菌研磨后，用灭菌生理盐水4倍稀释，经CAM途径连续传至10代，按照Reed-Muench法计算鸡胚半数感染量(EID50)。无菌分装后,置于-20 ℃冰箱保存。

1.2 病毒基因扩增及测序

提取第10代出现明显痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜DNA，参考GenBank中公布的ILTV目的基因片段核苷酸序列，针对ILTV基因组TK、gB、UL32、ICP4基因设计鉴定及测序引物(请参见OSID相关资料)。以提取所得的DNA为模板对目的片段进行扩增。扩增产物送北京擎科新业生物技术有限公司测序。

1.3 病毒的遗传进化与分子特征分析

使用DNAStar软件和Geneious等生物学软件进行序列拼接和分析；采用MEGA v.6软件中的Clastal W算法对所有核苷酸序列进行多重序列比对；基于邻接法(Neighbor Joining method)构建TK、gB、UL32和ICP4串联基因序列进化树；采用NetNGlyc在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)分析预测gB及UL32基因的糖基化位点。

1.4 动物回归致病性试验

将繁殖复壮后的ILTV-BT株以将104.0EID50·0.2 mL-1的剂量进行喉气管内回归接种10只2周龄SPF鸡，在14 d的观察期内，每天观察鸡的临床症状，试验期结束后，随机选取3只鸡进行剖检，观察喉头及气管的剖检变化。同时，另5只SPF鸡接种0.2 mL生理盐水作为空白对照组。

2 结 果

2.1 ILTV-BT株的分离鉴定与相似性分析

经CAM途径接种SPF鸡胚，连续传代出现稳定胚变，鸡胚绒毛尿囊膜增厚，有大小不等不透明白色病斑(图1A)。使用ILTVgB基因鉴定引物进行PCR扩增，获得了约1 360 bp大小的片段，与预期相符(图1B)。测序结果(未展示)显示，在4个基因中，ICP4基因的变异最大(98.68%～99.96%)，其次为gB基因(99.43%～100.00%)，TK基因(99.63%～100.00%)及UL32基因最为保守(99.89%～100.00%)。BT株与我国经典强毒株WG株的相似性最低(99.43%)，与疫苗株Serva的相似性最高(100.00%)。

M.Trans 5K DNA相对分子质量标准；P.阳性对照；C.阴性对照；BT.传代毒P10代

2.2 遗传进化分析与关键氨基酸位点

基于串联基因组的进化树分析显示，ILTV毒株具有明显的地理隔离特征，可分为澳大利亚、欧洲和中国3个主要进化分支，ILTV-BT株与其余国内流行分离株处于同一分支(图2)。氨基酸比对结果(未展示)显示，BT株与强毒株WG和1874C5的氨基酸差异主要集中于gB基因和ICP4基因。TK基因与WG株仅有一个氨基酸位点的差异(252T)，gB基因与WG株共有5个氨基酸位点差异，分别为44R、116V、551M、644I和707F，与1874C5株共有4个氨基酸位点差异，分别为116V、644I、799P和805K。有6个潜在的N-糖基化位点(102、121、211、262、360和649位)。UL32基因的441位存在1个潜在的N-糖基化位点。其与WG株在142和227位存在差异。与澳大利亚和美国分离株相比，BT株在ICP4基因87—90位存在4个氨基酸的缺失(AAQD)。其862—868位存在6个氨基酸的缺失(QPQEPQ)。此外，其在1 171位的氨基酸由甘氨酸G突变为谷氨酸E，该突变仅存在于LJS09序列中。

图2 ILTV-BT株串联基因组系统进化分析

2.3 ILTV-BT株动物回归致病性

在感染组接种后14 d观察期内未观察到呼吸道症状及死亡，仅观察到少量鸡出现精神沉郁及眼结膜分泌物，2～3 d后逐渐恢复(图3A、B)。剖检结果显示喉头气管正常(图3C、D)。空白对照组在整个试验观察期内未表现出任何临床症状，剖检显示喉头气管正常。

图3 ILTV-BT株感染鸡临床观察及气管剖检

3 讨 论

本研究中，BT株核苷酸序列与国内其他流行毒株相似性在97%以上，属于同一进化分支，未出现较大变异。但其与美国强毒株1874C5和国内标准株WG株等毒株差异较大，主要集中于gB和ICP4基因。gB基因与国内强毒株WG株的相似性最低，包含5个氨基酸位点的差异(44R、116V、551M、644I和707F)，而与弱毒疫苗株的相似性更高；WG株与国外强毒株如美国632强毒株、英国Throne强毒株的基因序列相似性为100%[12]，因此上述位点的差异可能为强毒株与弱毒株之间的毒力差异位点，并值得进一步研究；ILTV-BT株ICP4基因与美国强毒株1874C5和WG株等毒株差异也较大，有文献表明ICP4基因发生突变可能影响病毒毒力水平[9]。与国外分离株相比，BT株在87—90位和862—868位存在氨基酸缺失，文献报道这两个关键的氨基酸序列缺失可以减弱ICP4基因激活基因的表达，因此能够抑制潜伏感染的病毒重新活化[13]。ILTV-BT株的核苷酸序列与美国疫苗株Serva的同源性最高，而与澳大利亚疫苗株SA2和A20亲缘关系较远。不同地区之间分离株的差异也可能与所使用疫苗株来源的不同有关。

为了评估分离株对SPF鸡的致病性，笔者将ILTV-BT株感染2周龄SPF鸡，研究结果发现分离株可引起少量鸡出现精神沉郁及眼结膜症状，但没有出现鸡死亡。说明分离株对SPF鸡有一定的致病性，但致病力较温和。这也可能是造成类似低毒力毒株在鸡群中广泛传播和流行的原因。

4 结 论

通过对1株ILTV国内分离株进行部分基因序列测定分析及2周龄SPF鸡致病性研究，作者发现国内ILTV流行株以较温和的形式在鸡群中流行，并呈现出与近年来国外分离株不同的独特基因序列特征。