2017—2021年成都市猫细小病毒的检测及其VP2基因的变异分析

周 群，杨 苑，宋 鑫，何欣怡，曹 慧，张 斌,2*

(1.西南民族大学畜牧兽医学院，成都 610041；2.青藏高原动物遗传资源保护与利用教育部/四川省重点实验室，成都 610041)

猫细小病毒(feline parvovirus, FPV)为细小病毒科、细小病毒属的成员，是引起猫和其他猫科动物病毒性腹泻的主要病原体之一[1]。临床特征表现为高热、呕吐、腹泻、白细胞减少及出血性急性肠炎，具有高发病率和死亡率[2]。

FPV是体型最小的DNA病毒[3-4]。其基因组包含两种蛋白：非结构蛋白NS1和NS2，结构蛋白VP1和VP2[4-5]。VP2是构成FPV衣壳蛋白的主要成分，约占病毒粒子的90%[5]，决定了FPV在宿主范围、血凝性和抗原性方面的特点，在病毒感染过程中起关键性作用，常作为疫苗研发的靶抗原[3]。VP2蛋白氨基酸关键位点的突变常导致细小病毒感染发病机制和细胞嗜性发生改变，产生新的变异毒株，同时也常作为细小病毒分型的依据[6]。1965年首次从患病猫中分离出的FPV，目前已在全球范围内广泛流行[7]。犬猫细小病毒密切相关，可在各自的宿主中引起疾病[7-8]。VP2蛋白是决定犬细小病毒(canine parvovirus，CPV)和FPV抗原特性、宿主范围和受体结合的关键蛋白，由于CPV VP2蛋白5～6个关键的氨基酸发生变化，使CPV新变体毒株(CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c)获得了新的宿主范围，可同时感染猫和犬[6, 9-10]。

目前，商品化的FPV疫苗已在全球各国广泛应用，但FPV仍然在世界各国流行，并未得到有效控制[11-14]。国内对FPV的分子流行病学相关的调查研究较少，FPV在四川地区的流行情况和流行毒株的分子特征尚不明确[15-16]。本研究收集了来自成都市的168份猫腹泻粪便样本，用PCR方法进行FPV检测，旨在明确成都地区FPV的流行情况及其分子特征，丰富我国FPV的流行病学资料，为研发新型有效的FPV疫苗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料的采集 2017-2021年从成都地区3家宠物医院采集发病猫粪便样本168份，病猫均表现为腹泻、呕吐、食欲废绝和双相热等临床症状。采样并记录发病猫的性别和年龄等信息(表1)，将获得的粪便样本加入病毒保存液中，置于-80 ℃保存备用。

表1 样本信息及FPV检出情况

1.1.2 主要试剂与仪器 Quick Taq Hs DyeMix购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；STE缓冲液、蛋白激酶K、DL2000 DNA Marker购自TaKaRa生物技术有限公司；E.coliDH5α购自北京天根生化科技有限公司；PCR核酸扩增仪购自Bio-Red有限公司。

1.1.3 引物 参考相关文献报道[17]，合成用于FPV检测的引物FPV-F：GGATGGGTGGAAATCACAGC，FPV-R：ATAACCAACCTCAGCTGGTC。用于FPV VP2基因全基因组扩增的引物VP2-F：TTTGAATTCATGAGTGATGGAGCAGTT，VP2-R：GGGCTCGAGTTAATATAATTTTCTAGG。扩增片段分别长度为845和1 755 bp。以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 猫粪便样本总DNA的提取 采用酚-氯仿法分别提取猫粪便样本中的总DNA，提取完成后置于-20 ℃保存备用。

1.2.2 FPV的检测与VP2全基因组扩增 利用FPV检测引物[17]对本实验室保存的FPV阳性样本DNA进行PCR扩增，PCR产物纯化后与pMD19-T载体连接，转化到E.coliDH5α感受态细胞中，筛选阳性重组质粒由上海生工生物有限公司双向测序，将测序成功的阳性质粒10倍倍比稀释至10-4后保存备用。以168份样本的DNA为模板，使用Quick Taq Hs DyeMix进行FPV的检测和VP2全长的扩增，具体操作步骤参照说明书进行，每次PCR均设立阴、阳性对照。PCR产物经克隆和转化后送生工生物有限公司双向测序，获得FPVVP2基因全长序列。

1.2.3 细小病毒VP2基因遗传进化分析 将本研究获得的细小病毒VP2基因全长序列与GenBank中的38株国内外经典犬猫细小病毒株和5株犬猫细小病毒疫苗株的VP2基因参考序列进行比对分析。使用DNAstar中的MegAlign进行同源性分析，利用MEGA7.0序列分析软件，采用邻近法(Bootstrap自举值选择1 000次)构建系统遗传发育树。

1.2.4 统计学分析 通过卡方分析，使用非参数方法比较FPV检出率在品种、年龄和性别方面的差异。通过Epi InfoTM7.2软件进一步估计差异的比值比(odds ratio, OR)及其95%置信区间(95% confidence interval, 95% CI)。双因素ANOVA分析通过IBM SPSS Statistics 23.0进行分析。相关P值分别为<0.05或<0.01，则认为数值差异具有统计学显著性或高度显著性。

2 结 果

2.1 FPV检测结果与分析

用PCR方法对168份猫粪便样本进行FPV检测。结果显示成都地区猫群中FPV感染率高，118份样本检出FPV阳性，阳性率为70.2%(95% CI=62.7%～77.0%)。如表2所示，FPV在雄性猫和雌性猫中检出率分别为70.2%(33/47)、65.7%(23/35)。幼龄猫(≤6月龄)和成年猫(>6月龄)检出率则分别为80.6%(29/36)和56.3%(27/48)。纯种猫和混血猫的检出率分别为68.5%(37/54)和67.7%(21/31)。结果显示(表2)，成都地区FPV的感染率与猫的年龄(P=0.02)显著相关，但与猫的性别(P=0.81)和品种(P=1)均不相关。

表2 FPV的流行率与性别、品种和年龄的相关性

2.2 FPV VP2基因同源性分析

为进一步了解成都地区FPVVP2基因的分子特征和遗传变异，根据不同地区、生活环境和采样时间选取13份FPV阳性样本测定其VP2基因，获得13株FPVVP2基因全长序列(SMU-D3、SMU-D4、SMU-D28、SMU-D18、SMU-D14、SMU-D46、SMU-D50、SMU-D53、SMU-D74、SMU-D87、SMU-F33、SMU-SC20-6和SMU-SC20-2(GenBank No.MZ442302-MZ442314)。本研究中13株毒株之间的核苷酸序列同源性为97.2%～100%，氨基酸序列同源性为97.4%～100%；与GenBank中43株VP2基因参考序列之间的核苷酸同源性为97.1%～100%，氨基酸序列同源性为97.1%～100%。值得注意的是，本研究中SMU-D18和SMU-D14两株毒株与2株2019年中国报道的CPV毒株(GenBank No.MN473464.1、MN473463.1)同源性为100%，而与FPV毒株同源性为97.4%。氨基酸序列分析显示(图1)，SMU-D18毒株和SMU-D14毒株VP2蛋白的第426位氨基酸为Asn，与new CPV-2a毒株一致；此外，本研究中SMU-D46毒株的VP2蛋白氨基酸序列存在Ser293Phe和Ser297Phe两处独特的突变，另外10株毒株VP2蛋白与参考毒株相比均无明显的氨基酸突变。

图1 13株FPV毒株部分氨基酸序列比对图

2.3 FPV VP2基因遗传进化分析

利用MEGA7.0软件对13株FPVVP2基因序列进行系统发育分析显示(图2)，本研究所获得的毒株11株为猫细小病毒(FPV)，2株为猫源犬细小病毒(CPV)。SMU-D18毒株和SMU-D14毒株与CPV聚为一个大的分支，与FPV亲缘关系较远，与中国CPV毒株(GenBank No.MN473464.1、MN473463.1)亲缘关系最近，为猫源犬细小病毒。另外11株FPV与GenBank中已知的细小病毒VP2基因序列在进化树中聚为3个不同的分支，本研究暂命名为G1、G2和G3。4株本研究中的毒株(SMU-D3、SMU-SC20-2、SMU-SC20-6和SMU-F33)与6株分别来自亚洲和欧洲的毒株聚为G1型分支；G2型分支由来自欧洲、亚洲和美洲的9株毒株组成；7株本研究中的毒株同属于G3型，SMU-D46毒株单独形成一个分支，SMU-D4和SMU-D53毒株与我国2019年分离的毒株BJ006(GenBank No.MT270585.1)亲缘关系最近，SMU-D28、SMU-D87、SMU-D50和SMU-D74与4株我国分离的毒株在进化树的底端聚为一支。值得注意的是，猫细小病毒疫苗株Cu-4在系统发育树中位于G2分支中，与我国流行的FPV毒株亲缘关系较远。

●.本研究中的毒株; ■.犬、猫细小病毒疫苗株

3 讨 论

FPV具有高度传染性，是严重危害猫科动物所有成员的重大病原之一[7]。全球各国均有FPV的流行，但各国FPV的感染率差异较大，在28.4%～94.3%之间[11-14]。自首次分离以来，我国常有关于FPV的报道，但近年来FPV在我国西南地区猫群中的流行情况仍不清楚[15-16]。本研究采集了168份猫腹泻粪便样本进行FPV检测，检出率为70.2%，远高于我国以往报道的FPV的检出率(11.4%～38.4%)[16-17]。研究表明，FPV的检出率与患病猫的临床症状明显相关，腹泻猫粪便样本的检出率明显高于临床健康猫粪便样本[17]，这可能是本研究FPV检出率明显高于其他地区的原因之一。与之前的研究一致，本研究中FPV的检出率与患病猫的年龄显著相关，而与患病猫的性别和品种无显著相关性[17]。

在20世纪70年代后期，犬细小病毒2型(canine parvovirus-2, CPV-2)成为犬中的一种新病原体，原型CPV-2最初不能与猫转铁蛋白受体结合，因而不能感染猫[9]。然而，随后出现并取代CPV-2的遗传变异体CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c很快获得了对猫的感染性，这些CPV-2新抗原变体VP2蛋白第300残基均表现由Ala突变为Gly，引起的疾病与猫泛白细胞减少症无法区分[6,9-10]。1987年首次检测到原型CPV-2a的一个新的遗传变异体，在VP2氨基酸297残基从Ser到Ala发生非同义替换，被命名为new CPV-2a型并且在全球范围内流行[6]。而本研究中SMU-D18和SMU-D14毒株与FPV毒株的同源性为97.4%，却与new CPV-2a毒株同源性为100%，表明两株毒株为new CPV-2a毒株感染猫，为猫源犬细小毒株。

有趣的是，同样位于VP2氨基酸297残基，本研究中的SMU-D46毒株发生了与CPV不同的由Ser到Phe突变，同时在293残基处也发生了从Ser到Phe的独特的突变。以往的研究表明，new CPV-2a突变Ser297Ala虽然位于B抗原表位上，但其不会改变变体的抗原性质[6, 8, 18-20]，推测其可能会影响病毒与细胞受体的结合。然而，本研究SMU-D46毒株在293和297氨基酸位点均发生了同样的突变，这是否会引起FPV抗原类型的改变还有待进一步研究。表明new CPV-2a和FPV在我国猫群中共同流行[7]，巨大的进化压力导致CPV和FPV新变体不断出现，提示研究者应加强对CPV和FPV的监测和防控。

系统发育分析显示，本研究11株FPV毒株均与国内毒株亲缘关系较近，与GenBank中FPV参考毒株在进化树中聚为3个基因群，成都地区流行的FPV毒株分别位于G1和G3群中，两个基因群遗传关系相距甚远，7株毒株在G3群中又分别聚为两簇，提示成都地区FPV不仅流行率高，并且流行的毒株呈多样性，这更加不利于FPV的防控。与同源性分析结果一致，SMU-D46毒株在G3群中单独形成一个分支，与其他毒株表现出独特的遗传进化关系。值得注意的是，不论是CPV还是FPV疫苗株均未与我国流行毒株聚为一支，急需重新评估市售商品化疫苗对我国流行毒株的保护率，及早研发针对我国新型流行毒株的有效疫苗。

4 结 论

本研究调查了2017-2021年FPV在四川成都地区的流行情况，丰富了四川成都地区FPV的流行病学资料。FPV在成都地区猫群中流行率远高于我国其他地区，并且在VP2蛋白关键位点存在突变，产生了新的变体，同时存在new CPV-2a毒株的感染。