聚对苯二甲酸乙二酯微生物降解研究进展

覃伟洪,杨志祥,张海霞,丁功涛

(1.西北民族大学 生命科学与工程学院，兰州 730030；2.西北民族大学 生物工程与技术国家民委重点实验室，兰州 730030；3.西北民族大学 中国-马来西亚国家联合实验室，兰州 730030)

0 前言

聚对苯二甲酸乙二酯(PET)可以由苯二甲酸与乙二醇通过缩聚而成，以半结晶或无定型的形式存在，熔点为250～255 ℃。PET呈乳白色或浅黄色，表面平滑且有光泽，有较高的耐热性与稳定性，同时电绝缘性十分优良，在高温情况下，其电性能不会受太大影响[1]。

1930年—1960年，部分国家开始以化石为原料生产塑料，其中PET被广泛应用于包装、汽车及纺织行业[2]。据统计，2018年全球PET的生产量高达7 968万t，并且每年仍然以8.5%的速率在提升[3]。由于PET是一种有机高分子聚合物，在不经过任何处理的自然情况下难以得到快速有效的降解，如果将其丢弃在自然环境中，势必会对生态环境造成严重的损害。在农业中，大量使用的地膜未能全部除净，地膜会被分解成微塑料沉积在土壤中，不断富集，这会对土壤与农作物产生严重的危害：土壤的理化成分和微生物的群落结构发生改变；农作物的生长受到影响，微塑料的存在阻碍了植物吸收施溉的肥料[4]。与此同时，塑料污染也会对陆地生物造成影响，微塑料可以通过呼吸道进入动物体内，对动物机体造成不同程度的损害[5]。JIN Y X等[6]设计实验让小鼠食用塑料，随后对小鼠体内微生物群体进行分析，发现小鼠胃中多数有益的微生物消失，肠道菌群失衡，代谢功能混乱。不仅如此，人们常使用的皮肤清洁剂，如肥皂、洗面奶等，其中添加了塑料相关成分，被用于去除角质，这些含有塑料的清洁剂长期使用会导致塑料在皮肤上聚集，塑料逐渐渗入皮肤中，最终引起皮肤损伤[7-8]。这些无法降解的塑料不仅会危害动植物，对人类也会造成不良后果。而对于海洋而言，危害更加严重[9]。海洋中的污染主要来自于污水处理厂，即使工厂能够通过净水技术除去大部分的塑料，但随着排放量的扩大，塑料含量会不断增加，对海洋生物造成致命的威胁[10]。大量堆积的废弃塑料会被海洋生物摄入，使其生理出现异常，如内环境稳态失调、死亡等;部分摄入废弃塑料的海洋生物被打捞制成海产品后被人类购买并食用，也会对人体造成严重的危害[2]。因此，塑料污染一直是人类关注的焦点，解决塑料污染刻不容缓。

1 现阶段主要降解PET的方法

目前，处理PET的方法主要有填埋法、再生利用法、直接焚烧法、光分解法，以及生物降解法5种方法，其优缺点比较见表1[11-14]。

表1 PET处理方法比较

1.1 填埋法

填埋法是目前主流的处理废弃塑料的方法之一，将废弃塑料填埋在地底，旨在通过土壤中存在的以塑料为碳源的微生物进行自然降解。该方法成本低并且易实现，但是以破坏环境为代价，不符合可持续经济发展的要求[13]。由于被填埋的塑料没有经过任何处理，直接进行填埋，微生物无法对这些高聚物直接进行降解，即使能进行降解，降解速度也非常缓慢，导致土壤中的废弃塑料长时间滞留，极大地减少了土地耕种面积，并且导致土壤质量恶化，加重土地负担[11]。

1.2 再生利用法

再生利用法是指将废弃塑料通过分类回收后对其进行物理、化学等处理，使之能够分解为小分子的石油原料(烃类)，用于再生产[15]。该方法虽然有利于保护环境，但是难以实现垃圾分类，在处理废弃塑料的过程中，需要耗费较大的物力与财力，经济成本过高[16]。因此，再生利用法仍需要进行技术改良，降低经济成本，并且解决垃圾分类困难的问题。

1.3 直接焚烧法

1.4 光分解法

光分解法是指采用光线与催化剂将塑料分解成燃料，实现再利用的方法。该方法在处理塑料时不会产生温室气体，但所用光照为人造太阳光，光分解效率极低，且最终产物只有甲酸，产物单一化[13]。研究表明，该方法在分解塑料方面极具潜力，但该技术尚未成熟，难以实现完全降解。

1.5 生物降解法

生物降解法是极具前景的处理废弃塑料的方法之一。生物降解法通过微生物或微生物产酶对废弃塑料进行降解，降解过程中不产生任何有害气体，并且经济效益极高[14]。虽然该方法存在菌种培养条件严苛、发酵产物提取率低等问题，但是与其他方法相比仍具有较高的经济效益与降解速率，同时对环境无污染[2]。因此，该方法是处理废弃塑料的最佳方法。近年来许多研究人员发现了较多菌株或菌株分泌物能够将塑料降解为二氧化碳、水、乙醇等对环境无害的产物，为生物法降解塑料提供了有利条件。

2 生物降解法降解PET

生物降解法是指通过微生物或微生物的产物将底物分解为小分子的过程[17]。

在微生物降解PET塑料的过程中，大多数生化反应在细胞内进行，但高分子聚合物无法被微生物细胞直接吸收转化；因此，必须依靠产生的胞外酶对PET的表面膜进行分解，降低其分子质量，当分子质量降低到能够产生水溶性中间体时，微生物细胞可进行转化吸收，生成二氧化碳、水、甲醇等最终代谢产物，降解PET塑料[18]，微生物降解PET的过程见图1。微生物具有个体微小、结构简单、分布广和繁殖能力强等特点，通过微生物的作用不仅可以降解顽固、有害的废弃塑料，还能进一步修复生态环境。

图1 微生物降解PET过程

生物降解法主要采用发酵产物(主要为酶)，对塑料进行降解。降解PET的酶主要包括角质酶、酯酶、脂肪酶、降解酶PETase等[19]。这些酶需要进行酶工程或蛋白质工程改造后，才能最大化发挥降解作用。其中，角质酶及其同系物对PET表现出较大的降解潜力，与脂肪酶、酯酶相比，角质酶的底物特异性广泛，能够降解其他聚酯[20]。2016年，TANASUPAWAT S等[21]发现了一种新型的PET降解酶——PETase，其可将PET降解为对环境无污染的产物，为研究降解PET塑料提供了新的思路。

现阶段采用角质酶与PETase对PET进行降解的研究占大多数。采用脂肪酶的研究较少，主要原因为脂肪酶的活性中心被结构域阻碍，活性降低，应用较少[22]。酯酶只能对PET的表面亲水性进行改良，还未能达到降解的效果[23]。常用降解PET的酶见表2[24-27]。

表2 常用降解PET的酶

2.1 角质酶

MÜLLER R J等[18]通过实验证明，TfH属于角质酶的一种，能够降解结晶度为10%的PET薄膜，时间在3周左右，每周需要更换酶液，对比对照组，实验组PET的质量降低50%，该实验重复3次，确定损失的质量为降解的质量。为了进一步提高TfH的热稳定性，THEN J等[25]向其添加足够的量Ca2+、Mg2+，使酶中存留至少10 mmol的Ca2+、Mg2+，提高了酶的熔点，在65 ℃使PTE膜的质量损失率达到13%。

KAWAI F等[24]在日本采用堆肥法分离出一种角质酶。最先分离出了一株病毒体，名为绿色糖单胞菌AHK190，随后从该病毒体中获得一种新的PET降解酶——Cut190，经过酶工程的技术改造得到了最佳突变体Cut190。该突变体用丝氨酸(Ser)(该Ser被证明可以提高酶的稳定性，与被取代的Ser构型存在差异)与精氨酸(Arg)分别取代226位的Ser与228位的Ser，酶活性与热稳定性均有所提高。在63 ℃时，该酶可以降解低结晶度薄膜，降解率达到27%，比野生型的酶活性高出1.5倍左右；同时，该酶在65 ℃孵育1 h后，酶活性变化可忽略不计，甚至在70 ℃时仍有最高的酶剩余活性。

2.2 PETase

TANASUPAWAT S等[21]发现菌株Ideonellasakaiensis可分泌出两种酶，一种为PETase，另一种为MHETase，这两种酶可以形成一种新的分解PET的体系。PET与PETase相互作用时，PET会被分解为对苯二甲酸乙二醇二酯(BHTE)、MHET、对苯二甲酸(TPA)，PETase会继续与BHTE作用，将其降解为MHET，MHETase与MHET作用，将MHET降解为TPA与乙二醇(EG)。这两种产物对环境友好性极高，PETase在30 ℃下，与低结晶度PET作用6周，基本可以达到完全降解。PETase是目前降解速率与降解程度最高的酶。

PETase属于α/β水解酶折叠方式，其活性中心由9个β链组成，具有严格的催化三联体(S160-H237-D206)，结构中存在两个二硫键，在30～40 ℃催化效果更好[28]。与其他酶相比，该酶具有以下优势[2,20]：

(1)对PET具有高度的偏爱性，无法降解其他聚酯。

(2)在常温、中性pH的条件下能够降解PET，其他酶的温度相对较高。

(3)对低结晶度的PET降解率达到90%以上。

(4)对高结晶度的PET降解率比传统的降解酶高20倍左右。

(5)降解产物对环境友好性高。

虽然该酶显现出多种优势，但在实际应用过程中仍存在以下问题：

(1)无法达到PET的玻璃化温度(Tg)。高分子聚合物处于高弹状态(高于Tg的状态)时，酶更容易向非结晶区攻击，加快降解的速率[29]。PETase降解最适宜的温度处于30～40 ℃，酶促反应是在水溶液中进行的，Tg降低至60～65 ℃[19],两者存在较大差距。

为了进一步提高PETase的降解活性与热稳定性，SON H F等[30]采用蛋白质工程的手段，向PETase的活性位点中引入氢键，比野生型的PETase熔点提高8.81 K，两者在40 ℃进行降解，速率却提高了13.8倍。

(2)高聚合度PET降解速率低。PET降解酶更倾向于进攻聚酯的非结晶区，PETase也是，结晶度越高，降解速率越低。因此，在降解高结晶度聚酯的过程中，需要降低结晶度。先对塑料进行预处理(物理处理或化学处理)，再使用PETase进行降解，效果更佳。

(3)中间产物与酶的抑制剂结构相似。PETase将PET降解为BHET 和 MHET，这两种中间产物与酶的竞争性抑制剂结构相似，会与酶的活性位点进行竞争性结合，使酶无法与底物进行有效接触[2]。可以采用固定化酶的方法，将能够水解BHET和MHET的酶与PETase进行固定化，降低抑制剂的影响。

3 可行性研究

笔者基于现有研究，对采用生物降解法降解PET的可行性方法总结如下：

(1)继续分离高效分解PET的微生物。鉴于聚酯类塑料的顽强性，可以从较恶劣的环境中进行分离，如塑料废弃场、垃圾回收站等。一旦分离出新的微生物，可推动PET降解的发展。不过，该方法所需年限久、财力大，往往投入与回报不成正比，对研究人员的伤害较大。

(2)对现有的降解酶进行改造。经过近年的研究，有关人员已经将PETase的结构、降解过程、影响降解因素研究透彻，只要将其改造至符合工业化标准，即可应用到实际中。

可以对PETase进行以下几个方面的改造：提高产量、提高该酶热稳定性与酶活力、增大与底物的接触面积、提高酶的降解速率。

①提高产量：通过基因工程的手段，将PETase的基因转入感受态细胞中，与感受态细胞融合，构建过表达的工程菌，筛选出过表达的菌株，对产物酶进行酶活力测定，如果酶活性较高，符合降解的要求，即可投入生产。

②提高酶的热稳定性与酶活性：具有较高热稳定性的蛋白酶，通常结构内存在较多数量的二硫键，而PETase有2个二硫键，可将非活性中心的氨基酸残基替换成半胱氨酸，增加酶分子的二硫键，提高酶的热稳定性；向酶分子中加入某些二价金属离子，如Mg2+、Ca2+等，这些离子是酶的调节剂，能够提高其活性与稳定性。

③增大与底物接触面积：由于降解酶无法将PET聚酯高分子化合物直接吸收进行分解代谢，需要先吸附到其表面，从表面开始降解；当塑料被侵蚀成为水溶性的中间物时可被细胞转化吸收，最后降解为水、二氧化碳等物质。因此，需要增加酶分子与底物表面的接触面积。影响酶与底物接触的因素有两个，一为中间产物会与酶竞争性结合，二为高聚合物的直径。为了降低中间产物对酶的影响，可以加入分解中间产物的酶与PETase进行固定化，采用双酶体系进行降解。有关人员在使用角质酶对PET进行降解时，采用双酶体系进行降解，降解效果提高90%以上，因此，PETase在降解时也可以进行尝试。通过物理或者化学方法对底物进行预处理，将其破碎为颗粒直径大小，酶与底物的结合会更充分。

④提高酶的降解速率：酶更倾向于进攻非结晶区，聚合度越高、结晶度越高，酶的降解速率就越低。可以采用化学方法先解聚PET，使之成为低聚物，增加非结晶区比例，使酶分子进攻靶点的精确度提高、降解速率提升。

4 结语

随着塑料污染的不断加重，国家越来越重视该问题，并采取多方面的措施，旨在有效缓解塑料污染问题。在法律上，从限塑令到禁塑令，从根本上解决塑料制品的产生；在生活上，呼吁人们减少塑料袋的使用，使用环保购物袋；在处理塑料上，采用经济效益高，且对环境友好的处理方法。由此，提出以下展望：

(1)进一步研究生物法降解塑料机理。微生物的种类繁多，习性存在较大差异，目前有研究表明，某些昆虫在体内可降解塑料，如黄粉虫在体内就可将塑料降解，原因是肠道内存在可降解的塑料微生物，但降解机理有待考究，在未来仍有较大的研究发展空间。

(2)开发塑料替代材料。减少生活中不可降解塑料的使用，可以从生物体内提取出有效成分制备成可降解环保材料，这种材料可以被分解为大分子可降解聚合物，在使用的过程中减轻塑料污染。

(3)进一步改造塑料降解酶，提高降解能力。目前，野生菌所分泌的酶，在降解过程中虽然有较好的表现，但是产量低、应用成本高，不利于应用到实际生产中;因此，需要对其进行改造，构建出具有高降解能力的菌株，才能减轻污染。