油茶饼粕经3种霉菌发酵后养分对比*

张 晖 吴雪辉 董 斌 黄永芳

（1.仲恺农业工程学院，广东 广州 510225；2.华南农业大学，广东 广州 510642；3.广东农工商职业技术学院，广东 广州510507）

油茶Camellia oleifera属山茶科常绿小乔木，是世界四大木本油料作物之一，我国特有树种，主要分布在我国南方亚热带地区。油茶除可作为优质食用油，还可用于高级化妆品、精油等产品；油茶粕可生产有机肥和生物农药；茶壳可提炼茶碱、栲胶等。近年油茶在茶籽产量、种植面积、产油量、产值上均处于逐年稳步提高态势。油茶产业成为南方很多产区加快农村经济调整的特色产业，是扶贫攻坚和乡村振兴的支柱产业[1]。

油茶研究的热点主要在提升价值方面，例如茶油抗氧化活性、皂素等的相关研究。茶粕中的茶皂素具备抗菌消炎、抗高血压、抗渗透和抑制酒精吸收等生物活性[2]。关于油茶籽的研究包括茶油、茶皂素、茶籽多糖、茶蛋白、糠醛等产品在医药、保健、日化、建材等行业中的应用情况[3-4]。我国每年产生的油茶籽在100 万t 左右，会产生约70 万t/年油茶饼粕[4]。目前为止只有少数学者对茶粕的固体发酵工艺进行研究[5]。如何有效利用油茶饼粕，特别是油茶饼粕在未进行茶皂素去除的背景下，添加特异菌种后，会否因茶皂素的存在，其菌丝生长受到抑制进而影响到茶粕有机肥利用，这方面一直未有人研究。本试验选用了作为多种植物病原菌的拮抗菌，同时也是一种生防菌的哈茨木霉Trichoderma harzianum[6]、可产生纤维素酶与半纤维素酶的黑曲霉Aspergillus niger[7]、以及在食品发酵方面用得比较多，能分泌蛋白酶的鲁氏毛霉Mucor roxianus[8]3 种霉菌作为发酵研究对象。在设置不同环境温度和油茶饼粕含水量时比较3 种霉菌的生长状况[9]，进一步分析发酵后油茶饼粕中养分变化，为油茶饼粕发酵有机肥利用提供相关数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 本试验采用的菌种包括3 种霉菌，分别为哈茨木霉（简称木霉）、黑曲霉、鲁氏毛霉（简称毛霉），均购于广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心，为冻干菌种。

1.1.2 油茶饼粕 实验用的油茶饼粕购于广东新大地生物科技有限公司，为未脱茶皂素的油茶饼粕，茶皂素含量在11%～12%，有效氮含量为1 134 mg/kg，有效磷含量为2 266 mg/kg，有效钾含量为11 320 mg/kg。

1.2 试验设计

将未脱茶皂素的油茶饼粕分装到组培瓶中，每个组培瓶装30.0 g，并于105 ℃下灭菌4 h（对照组不作灭菌处理）。灭菌后加入无菌水使茶饼粕最终含水量分别为40%、50%、60%、70%，分别接入试验用的菌体2 mL（105cfu/mL）于油茶饼粕中，材料置于20、30 、40 ℃的人工气候箱中(表1)，试验进行完全组合，每个处理3 个重复，定期观察菌体生长情况及油茶饼粕变化。

表1 试验设计Table 1 Experiment design

1.3 数据收集与分析

在试验进行第30 天将材料于60 ℃ 烘箱烘干，粉碎后过200 目筛。测定其有效氮、有效磷、有效钾含量，测定方法参照《土壤农化分析》[10]。数据采用SAS9.4 进行方差分析与多重比较。

2 结果与分析

2.1 油茶饼粕发酵后有效氮变化

本试验进行过程中，虽然油茶饼粕是置于封盖的组培瓶中进行，但由于在40 ℃时，水分仍然可从瓶中蒸发走，致使油茶饼粕变干，3 种菌无法在油茶饼粕中正常生长，而如果在试验过程中添加水分，将会使得试验中的茶粕含水量无法达到各处理要求，所以本试验结果不包括40 ℃的处理，可认为此条件不适宜本试验条件的固态发酵处理。

各温度水平间，20 ℃对有效氮含量的促进作用优于30 ℃(表2)，前者有效氮的均值是后者的1.18 倍，差异呈极显著。含水量40%与60%、70%有极显著差异，40%与50%之间差异不显著，60%也优于70%。结果显示含水量在40%、50%时适合作为油茶饼粕发酵的条件，而含水量在70%时不利于养分的积累。

表2 油茶饼粕养分多重比较Table 2 Multiple comparison of nutrients in oil-tea cake

油茶饼粕经对照发酵以及接种毛霉、木霉和黑曲霉发酵后有效氮含量见表3 所示，在对照处理中，有效氮含量除20 ℃+50%处理外，其他处理的有效氮含量均较发酵前低。接种的3 种霉，在20 ℃，含水量40%、50%和60%条件下，有效氮含量均比发酵前高，而在30 ℃，含水量50%、60%和70%时，有效氮含量均比发酵前低。

表3 油茶饼粕固体发酵后有效氮含量Table 3 The contents of available nitrogen after oil-tea cake(Camellia) fermentation

从总的结果来看，有效氮含量最高的前3 个处理分别为：毛霉+20 ℃+40%、黑曲霉+20℃+40%、黑曲霉+20℃+50%，它们比发酵前油茶饼粕有效氮分别增长39.14%、30.37%、

25.68%，与同一温度、含水量条件下的对照处理中的有效氮含量相比分别提高了50.87%、41.37%、15.16%；而有效氮含量最低的是木霉+30 ℃+70%，发酵后降低了25.96%，比同条件的对照处理少8.76%。

综合菌种、温度、含水量3 个因素的各水平间的邓肯检验结果，毛霉+20 ℃+40%、黑曲霉+20 ℃+40%、黑曲霉+20 ℃+50%这3 种处理组合在油茶饼粕发酵有效氮养分增加的最优，其发酵后有效氮含量较高。毛霉+20 ℃+40%的有效氮含量达到1 577.80 mg/kg，比相同条件对照处理的有效氮含量高51%。

2.2 油茶饼粕发酵后有效磷比较

菌种各水平间邓肯检验（表2）结果显示黑曲霉、木霉优于对照和毛霉，而黑曲霉与木霉之间差异不显著，对照与毛霉之间差异也不显著。接种黑曲霉与木霉后有效磷含量均明显比对照组，前二者有效磷含量均值分别为3 206.40、3 132.82 mg/kg（表4），分别为对照组的1.12 倍和1.10 倍。

表4 油茶饼粕固体发酵后有效磷含量Table 4 The contents of available phosphorus after oil-tea cake(Camellia) fermentation

温度对油茶饼粕有效磷含量有显著影响，其中，在20℃时有效磷均值为3 068.37 mg/kg，较30℃的高。含水量邓肯检验显示50%、60%与70%、40% 间 差 异 显 著，而50% 与60% 之 间、70%与40%之间差异均不显著。

油茶饼粕发酵后有效磷含量，除了木霉+30℃+40%外，其他各处理的有效磷含量均比发酵前高。有效磷含量排在前面的组合分别是黑曲霉+20 ℃+50%、毛霉+30 ℃+50%、黑曲霉+30 ℃+50%，它们较发酵前分别增加64.14%、59.00%、56.32%，其较同一条件下对照组分别高了38.98%、17.48%、15.50%；而有效磷含量最低的是毛霉+30 ℃+40%，发酵后较发酵前降低7.73%，比同条件下的对照组低8.59%。50%条件下发酵的有效磷均值最高，为3 230.24 mg/ kg，60%次之，为3 094.84 mg/ kg，40%只有2 726.5 mg/ kg。对各因素下各水平间的邓肯检验中可得出，黑曲霉+20℃+50%为最优组合，有效磷含量分别为3 696.30 mg/kg；次优组合为木霉+30℃+60%，其有效磷含量为3 603.4mg/kg。

2.3 油茶饼粕发酵后有效钾比较

木霉、黑曲霉与毛霉、对照间差异显著（表2），木霉与黑曲霉间差异性不显著。其中，木霉作用后的有效钾均值最高，达到11 173.5 mg/kg，而黑曲霉则为10 785.3 mg/kg。两个温度水平间差异不显著。含水量50%的有效钾均值最高，为10 723.1 mg/kg，与70%差异显著，但与40%、60%间差异不显著。

大部分处理组的有效钾含量均比发酵前低（表5），其中对照+20℃+60%处理组的有效钾含量损失最多，降低了40.02%。而接种木霉后在20℃，含水量40%、50%、60%条件下，其有效钾含量比发酵前高，在12 500 mg/kg 左右。结合多重比较结果，可以推出较优组合为木霉+20℃+60%、木霉+20 ℃+50%、木霉+20 ℃+40%，12 628.3、12 575.0、12 326.4 mg/kg，说明接种木霉对油茶饼粕有效钾增加有显著作用。

表5 油茶饼粕发酵后有效钾含量Table 5 The contents of available potassium after oil-tea cake(Camellia) fermentation

3 结论与讨论

油茶饼粕在经过3 种霉菌发酵处理后，促进有效氮增加的较优组合为：毛霉+20℃+40%、黑曲霉+20 ℃+40%、黑曲霉+20 ℃+50%。所有处理组的有效磷含量均有所增加，其中黑曲霉+20℃+50%组合比发酵前增加64.14%。有效钾增长不显著，在30℃下全部处理发酵后有效钾的结果都比发酵前要低。推出较优的组合为较优组合为木霉+20℃+60%、木霉+20℃+50%、木霉+20℃+40%。

从试验中设置的菌种、温度、含水量3 个因子对油茶饼粕中有效氮、有效磷和有效钾的综合结果来看，黑曲霉在含水量为50%时，对油茶饼粕的固态发酵总体养分的转化具有明显的促进作用。茶皂素在油茶饼粕中的含量约为11%-13%，此含量对典型革兰氏阳性细菌、阴性细菌已具有显著抑制效果, 通过抑制菌体蛋白质的合成，干扰细胞的正常代谢过程[11-13]，进而产生抑菌生物活性和毒杀效果[14-17]。

因此在利用油茶饼粕作为有机肥应用有两方面的问题需要衡量，一是以提取茶皂素后的油茶饼粕作有机肥原料，虽其有利于微生物的生长，但是，提取茶皂素后的茶粕也会损失大量的养分；二则是如果采用未脱茶皂素的油茶饼粕直接发酵作有机肥，必须采用对茶皂素耐受性的菌种搭配，以避免菌丝在生长过程受到抑制。在前期工作中已观察到3 种霉菌在未脱茶皂素油茶饼粕中生长缓慢，在已脱茶皂素油茶饼粕中生长较快[9]。丁丽霞[18]利用黑曲霉对油茶粕进行固态发酵以降解茶皂素，说明黑曲霉对茶皂素具有一定的耐受性。Sariri 等[19]通过利用黑曲霉和植物乳杆菌对雨豆树Sammanea saman的叶进行处理，显示其可以有效减少叶中的皂苷类物质，说明黑曲霉在发酵应用中具有较强的适应能力。朴哲等[20]与尹永强[21]的研究结果显示在针对家禽粪堆肥试验中，速效钾含量明显上升。但本试验结果显示有效钾的含量普遍呈现下降趋势。究其原因，可能与茶皂素的存在有关，同时，堆肥在发酵过程涉及到多种微生物共同作用[22]。本研究下一步的重心将在油茶饼粕与不同有机肥原料的复配，通过调整碳氮比和pH，构建有利于菌体生长的环境。