沉默信息调节因子在姜黄素减轻炎症反应改善压力性心肌肥厚中的作用

熊凤梅，刘瑞萍，郭焕利，武冬梅，孙 娜

心肌肥厚是心脏在前负荷和／或后负荷超载时所作出的重塑性反应［1］。慢性压力负荷增大会增加心肌壁厚度、纤维化程度和炎性细胞浸润，导致心肌顺应性降低和血流动力学障碍。研究表明，持续的压力负荷增加引起的心肌肥厚是心力衰竭的独立危险因素，是导致心力衰竭的重要原因，并伴有严重的不良事件，如呼吸衰竭和心脏骤停［2］。而钙稳态失衡、活性氧（reactive oxygen，ROS）堆积、线粒体功能和代谢障碍、纤维化、细胞死亡和炎症反应等在压力负荷导致的心肌肥厚中发挥重要作用［1］。姜黄素（curcumin，Cur）是从姜科中提取出来的一种天然植物化合物，由于其具有抗氧化、清除ROS、抗炎、抗肿瘤等多种药理学特性［3－5］，近年来在压力负荷引起的心肌肥厚中的作用也逐渐受到关注。有研究表明，Cur可以激活mTOR抑制自噬改善异丙肾上腺素诱导的心肌肥厚［6］。同时，Cur还能上调钠钙交换体，改善心脏收缩和舒张功能，抑制压力性心肌肥厚［7］。结果表明，Cur在压力性心肌肥厚中发挥保护作用。然而Cur能否通过抑制炎症反应改善压力性心肌肥厚还不清楚，其具体作用机制也未阐明。沉默信息调节因子（silent information regulator，SIR）属于NAD＋依赖的Ⅲ型去乙酰化酶，在哺乳动物细胞中存在有SIR T1－7亚型［8］。过去十年间，已经有大量研究结果证实SIRT1信号在心血管疾病中发挥保护作用。其中，SIRT1在缺血性心脏病、血管老化、葡萄糖稳态调控、动脉粥样硬化等方面的作用较为清楚［9－11］。然而，SIRT1在心肌肥厚中的作用研究较少，具体机制仍有待阐明。同时，Cur能否调控心肌肥厚中SIRT1信号目前还不清楚。本实验拟采用主动脉缩窄术（transverse aortic constriction，TAC）构建压力负荷增大引起的心肌肥厚模型，探讨Cur减轻炎症反应改善压力负荷引起心肌肥厚的作用及其对SIRT1信号的调控机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 48只8周龄健康C57／BL6雄性小鼠，体质量20～25 g；由西安交通大学实验动物中心提供，购买后饲养在温度为（24±2）℃、湿度为55%～65%的环境中，12 h光照／黑暗循环，各组小鼠均可自由获取食物和水。所有实验操作均严格遵循西安市儿童医院伦理委员会制定的动物饲养和使用指南。

1.2 制备TAC模型以及实验动物分组 用2%异氟烷将小鼠麻醉好后，仰卧位将四肢固定在恒温板上。按照以往文献报道的手术方法［12］，在第二肋间纵向剪开皮肤，并逐层分离肌肉，暴露横主动脉弓，在无名动脉和左颈动脉之间预先穿一根7－0号丝线，用丝线将一根27号的针头和血管结扎固定，然后将针头取出并逐层缝合肌肉和皮肤。假手术组小鼠暴露横主动脉弓并穿线但不结扎，其他操作和手术组相同。48只C57／BL6小鼠随机分为假手术组（Sham）、TAC组、TAC＋Cur组和TAC＋Cur＋EX527组，每组12只。根据文献报道确定Cur灌胃给药，浓度为150 mg／kg，EX527经腹腔注射给药，浓度为5 mg／kg［13－14］。

1.3 小鼠心脏超声评价心脏功能 用2%异氟烷将C57／BL6小鼠麻醉，并用脱毛膏将待测小鼠胸前区的体毛去掉，将小鼠四肢与恒温平台的电极接触并固定，实验中实时进行心电监测。采用Vevo2100超声成像系统进行经胸超声心动图检测。采用M超在心脏短轴乳头肌水平记录心脏功能。用Vevo Lab 3.1软件测量各组小鼠超声数据并计算左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左室缩短分数（left ventricular fractional shortening，LVFS）。

1.4 苏木素（hematoxylin，HE）染色观察心肌细胞横截面积 术后6周时取材，用2%异氟烷麻醉小鼠，颈动脉取血，并快速开胸取出心脏，在预冷的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer，PBS）中反复冲洗。将各组心脏放入相应标记的盛有4%多聚甲醛离心管中，室温放置两天后行石蜡包埋、切片。HE染色步骤：在二甲苯和梯度酒精中将石蜡切片脱蜡复水；HE染细胞核；伊红染细胞质；中性树胶封片；用Image J软件测量各组心肌细胞横截面积。

1.5 Masson染色观察心脏纤维化 术后6周时取材，用2%异氟烷麻醉小鼠，颈动脉取血，并快速开胸取出心脏，在预冷的PBS中反复冲洗。将各组心脏放入相应标记的盛有4%多聚甲醛离心管中，室温放置两天后行石蜡包埋、切片。Masson染色步骤：石蜡切片脱蜡复水；HE染核；Masson丽春红酸性复红染液复染；1%磷钼酸水溶液处理后直接用苯胺蓝染色；酒精和二甲苯透明处理，中性树胶封片。Image J软件测量各组心脏纤维化面积比例。

1.6 蛋白免疫印迹法检测相关蛋白的表达 称取各组小鼠左室50 mg心肌组织，加入RIPA裂解液和磷酸酶抑制剂提取蛋白；在上清中加入上样缓冲液，并在96℃金属浴煮10 min，然后将蛋白样品分装并保存在－80℃冰箱；配制十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）凝胶，每孔上样蛋白量为30μg，电泳1.5 h，恒流240 mA转膜80 min，用5%脱脂奶粉室温下将聚偏氟乙烯（PVDF）膜封闭1.5 h，并与相应的SIRT1、乙酰化转录因子（Acetylated transcription factors，Ac－FOXO1）、心房利钠肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）、肿瘤坏死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）、白介素（interleukin，IL）－1β、IL－6和磷酸甘油醛脱氢酶（phosphoglyceraldehyde dehydrogenase，GAPDH）抗体4℃孵育过夜；洗膜缓冲液（tris buffered saline tween，TBST）漂洗3次，每次10 min，室温孵育二抗2 h，TBST漂洗3次，每次10 min，化学发光（ECL）显影，GAPDH为内参。用Image Lab软件进行灰度值分析并统计。

1.7 统计学处理 应用SPSS 18.0统计软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析（One－way ANOVA），当差异具有统计学意义时再运用SNK－q检验进行两组间比较，计量数据采用均数±标准差（±s）表示，P＜0.05代表差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EX527阻断Cur对压力负荷引起的心肌肥厚的保护作用 Sham组心肌横截面积为（212.7±7.6）μm，心肌纤维化比例为（1.46±0.5）%，心脏重量／体重比值为（4.94±0.31）；TAC组心肌细胞横截面积为（384.3±13.4）μm，心肌纤维化比例为（11.7±1.8）%，心脏重量／体重比值为（7.1±0.57），与Sham组比均明显增大（P＜0.01）；TAC＋Cur组心肌横截面积为（226.1±8.9）μm，心肌纤维化比例为（3.4±0.7）%，心脏重量／体重比值为（5.1±0.24），与TAC组比均明显减小（P＜0.01）；TAC＋Cur＋EX527组心肌横截面积为（387.5±15.7）μm，心肌纤维化比例为（12.2±1.3）%，心脏重量／体重比值为（7.08±0.39），与TAC＋Cur组比均明显增加（P＜0.01）。见图1。

图1 EX527阻断姜黄素对心肌肥厚和纤维化的抑制作用

2.2 EX527阻断Cur减少压力负荷引起的ANP和BNP表达的作用 免疫印迹结果显示，TAC组小鼠心肌ANP和BNP的相对表达量为（2.33±0.15）和（2.11±0.1），与Sham组比均明显增加（P＜0.01）；TAC＋Cur组心肌ANP和BNP的相对表达量为（1.23±0.1）和（1.13±0.09），与TAC组比均明显减少（P＜0.01）；TAC＋Cur＋EX527组心肌ANP和BNP的相对表达量为（2.4±0.17）和（2.14±0.13），与TAC＋Cur组比均明显增加（P＜0.01）。见图2。

图2 姜黄素降低小鼠心肌组织中ANP和BNP表达的作用被EX527阻断

2.3 EX527阻断Cur改善压力负荷引起的心肌肥厚心脏功能的作用 心脏超声结果显示Sham组LVEF和LVFS值分别为（71±3）%和（40.7±1.3）%；TAC组LVEF和LVFS值分别为（40±1）%和（23.7±0.8）%，与Sham组比均明显降低（P＜0.01）；TAC＋Cur组LVEF和LVFS值分别为（57±1.5）%和（35.1±1）%，与TAC组比均明显增加（P＜0.01）；TAC＋Cur＋EX527组LVEF和LVFS值分别为（41±1.8）%和（23.2±0.9）%，与TAC＋Cur组比均明显降低（P＜0.01）。见图3。

图3 EX527阻断姜黄素改善心肌肥厚心脏功能

2.4 EX527阻断Cur对压力负荷引起的心肌肥厚中炎性因子的抑制作用 免疫印迹结果表明TAC组心肌TNF－α、IL－6和IL－1β的相对表达量分别为（1.93±0.08）、（2.11±0.11）和（1.87±0.07），与Sham组比均明显增加（P＜0.01）；TAC＋Cur组心肌TNF－α、IL－6和IL－1β的相对表达量分别为（1.08±0.1）、（1.22±0.09）和（1.05±0.08），与TAC组比均明显减小（P＜0.01）；TAC＋Cur＋EX527组心肌TNF－α、IL－6和IL－1β的相对表达量分别为（2.02±0.12）、（2.15±0.03）和（1.96±0.03），与TAC＋Cur组比均明显增加（P＜0.01）。见图4。

图4 EX527阻断姜黄素对心肌肥厚中炎性因子表达的抑制作用

2.5 EX527阻断Cur对压力负荷引起的心肌肥厚中SIRT1信号的激活作用 免疫印迹结果表明TAC组心肌SIRT1的相对表达量为（0.42±0.05），与Sham组比明显减少（P＜0.01），而其底物Ac－FOXO1的相对表达量为（2.05±0.12），与Sham组比明显增加（P＜0.01）；TAC＋Cur组心肌SIRT1的相对表达量为（0.79±0.07），与TAC组比明显增加（P＜0.01），Ac－FOXO1的相对表达量为（1.17±0.09），与TAC组比明显减少（P＜0.01）；TAC＋Cur＋EX527组心肌SIRT1的相对表达量为（0.39±0.04），与TAC＋Cur组比明显减少（P＜0.01），Ac－FOXO1的相对表达量为（2.14±0.08），与TAC＋Cur组比明显增加（P＜0.01）。见图5。

图5 EX527阻断姜黄素对心肌肥厚中SIRT1信号的调控作用

3 讨 论

压力性心肌肥厚常见于心肌病、瓣膜病和高血压［15－17］，诊治不及时会逐渐进展为心力衰竭并严重危害患者生命［18］。Cur是具有多种药理学活性的天然化合物，因无毒副作用，成为治疗临床疾病的潜在药物。已有证据表明Cur可通过调控钙稳态、纤维化、自噬、线粒体功能和氧化应激在心血管疾病中发挥保护作用［19－20］。然而Cur在压力负荷引起的心肌肥厚中的作用机制并不十分清楚。本研究采用TAC模型模拟压力性心肌肥厚，首先观察了Cur在压力性心肌肥厚中的作用。与以往的报道一致［6－7］，本研究结果表明Cur能改善TAC引起的心肌肥厚和心脏功能障碍。同时，本研究还观察到SIRT1抑制剂EX527能够阻断Cur改善TAC所致心肌肥厚的作用，这提示SIRT1参与Cur改善压力性心肌肥厚的作用。

炎症反应和纤维化是压力性心肌肥厚心脏重构中常见的病理因素，与左室结构和功能的损伤程度具有一定的相关性［21］。研究表明TNF－α、IL－6和IL－1β等促炎因子表达的增加促进了压力性心肌肥厚的形成［22］。而炎症反应的启动又会引起细胞外基质聚积，加速心肌纤维化进程［23］。本实验结果表明，Cur能减小心肌细胞横截面积、心脏／体重比值以及ANP和BNP表达，并改善心脏功能，同时抑制纤维化和TNF－α、IL－1β和IL－6表达，这些结果说明Cur能改善TAC引起的心肌肥厚，并减轻心肌纤维化和炎症反应。然而EX527能阻断Cur对TAC引起的心肌肥厚、纤维化和炎症反应的抑制作用，提示SIRT1在压力性心肌肥厚炎症反应和心肌纤维化的调控中发挥重要作用，同时，该结果提示SIRT1可能是Cur改善TAC引起的心肌肥厚的重要作用靶点。

大量研究表明SIRT1在心血管疾病、神经退行性疾病、衰老和肿瘤等多种疾病中发挥重要作用［24－26］。Cur能激活SIRT1减轻心肌梗死引起的纤维化［27］；在糖尿病心肌病中，Cur能通过SIRT1－FOXO1和磷脂酰肌醇3激酶－蛋白激酶B（PI3KAKT）信号抑制氧化应激和细胞凋亡［28］。然而，SIRT1表达的变化在压力性心肌肥厚模型中的作用仍不十分清楚。本实验结果证实，在TAC引起的压力性心肌肥厚中，SIRT1表达降低，其底物FOXO1的乙酰化水平增加。而Cur能上调SIRT1的表达，抑制FOXO1的乙酰化水平。然而，EX527能阻断Cur对SIRT1和Ac－FOXO1表达的调节作用。因此，综合以上这些结果提示Cur可能通过调控SIRT1信号抑制心肌纤维化和炎症反应减轻压力性心肌肥厚。

综上所述，压力性心肌肥厚作为心力衰竭的独立危险因素，寻找预防和治疗的方法至关重要。本研究证实Cur具有改善压力性心肌肥厚的作用，其作用与抑制SIRT1活性，减轻炎症反应和纤维化有关。