利用肝脏穿刺法对奶牛酮病的诊断

陈淑蕾 ， 邓 亮 ， 刘天龙 ， 朱春燕 ， 朱怡平 ， 李 靖

(1.中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 沈阳农业大学畜牧兽医学院 ， 辽宁 沈阳 110866 ；3. 上海市农产品质量安全中心 ， 上海 青浦 201708)

奶牛酮病(Ketosis)是高产奶牛围产期由于碳水化合物和脂肪代谢紊乱，导致脂肪酸代谢产物酮体在血液中的异常累积引起的一种代谢性疾病，又称为酮血症。酮体包括乙酰乙酸、β-羟丁酸以及丙酮酸。当酮体在血液达到一定浓度后，会出现酮乳和酮尿等症状，常见的症状还包括低血糖、消化机能紊乱、产奶量下降等，偶尔伴发神经症状[1-2]。据调查研究显示，我国奶牛酮病发病率为10%～40%[3-4]，欧美国家奶牛酮病发病率为2%～20%[5]。Holtenius等[6]将酮病分为Ⅰ型、Ⅱ型和青贮丁酸型3种，是目前比较经典的酮病分类方法。Ⅰ型酮病常发于产后3～6周，此时奶牛产奶量达到高峰，泌乳所需能量增加，若营养摄入不足无法满足奶牛能量需求，导致脂肪的过度动员，则会发生Ⅰ型酮病。Ⅱ型酮病又称为脂肪肝型酮病，常见于过度肥胖的奶牛，其发病机理与Ⅰ型酮病有所不同。肥胖奶牛分娩前由于子宫占据腹腔大部分空间导致瘤胃的食物贮存量降低，因此在出现能量负平衡后进行脂肪动员造成肝脏脂质堆积，导致肝功能衰竭而无法代谢大量游离脂肪酸而发病，因此产后1～2周是Ⅱ型酮病的高发期。青贮丁酸型酮病是由于奶牛采食了大量含丁酸的青贮饲料引发的酮病，其发病机制还需进一步研究[7]。

安徽省某奶牛场荷斯坦奶牛出现采食量下降、产奶量减少的情况，经过实验室检测并采用肝脏活检技术进行病理学诊断，确诊该场泌乳奶牛患Ⅱ型酮病。报告如下。

1 发病经过

安徽省某奶牛场荷斯坦奶牛在产后4～9 d先后出现精神沉郁、采食量下降、泌乳量减少、尿液带烂苹果气味等症状，发病泌乳期奶牛年龄为3～8岁，妊娠后期除体况评分较高之外并未发现明显异常。

2 组织病理学检查

分别对出现上述临床症状的5头泌乳期奶牛、5头妊娠期奶牛进行肝脏活检取样。选取右侧第11肋间距背线下约20 cm处做1条垂线，肩胛骨外缘平行于背线做1条直线，2条线交叉处即活检穿刺位点，对应肝脏右叶。在穿刺部位20 cm×20 cm区域用碘伏进行消毒，并用利多卡因局部麻醉后在穿刺位点做1个小的皮肤切口，随即使用活检针穿刺取样。得到长0.5～1.5 cm、厚0.1 cm的肝脏组织，经10%福尔马林固定后制作病理切片，进行H.E.染色后镜检。5头泌乳期奶牛肝脏全部发生广泛性脂变，肝小叶出现广泛性脂质沉积，肝细胞肿大，胞浆内充满大小不一的空泡(脂滴)，并将细胞核挤向旁侧，呈空泡变性(图1)，切片可见肝索紊乱，小叶间胆管增生(图2)。妊娠期奶牛肝脏病变相比于泌乳期奶牛较为轻微，但也已经发生由于脂质侵入而造成的肝脏损伤，其中1头妊娠期奶牛已经发生轻度脂变(图3)。

图1 泌乳期奶牛肝脏活检切片(H.E.染色，200×)切片可见肝小叶广泛性脂变，肝细胞空泡变性

图2 泌乳期奶牛肝脏活检切片(H.E.染色，400×)切片可见肝索紊乱，小叶间胆管增生

图3 妊娠期奶牛肝脏活检切片(H.E.染色，400×)切片可见肝小叶发生轻度脂变

3 实验室检查

结合临床症状与发病时期，对泌乳期奶牛及妊娠期奶牛进行总蛋白、白蛋白、甘油三酯、肌酐、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、血酮指标的实验室生化检测(表1)，并对活检肝脏进行甘油三酯浓度的测定。发现泌乳期奶牛血清谷草转氨酶指标显著升高(P=0.010)，血酮指标显著升高(P=0.015)，其他生化指标差异性不显著。活检肝脏甘油三酯浓度显著升高(P=0.045)，而血清生化指标未表现显著差异。

表1 血清及活检肝脏生化指标 n=5

4 诊断

肝脏穿刺活检以及实验室检查结果显示，泌乳期奶牛肝脏发生脂变，甘油三酯升高伴发血酮升高，结合奶牛临床症状、发病时间，确诊该奶牛场泌乳期奶牛患Ⅱ型酮病。

5 讨论

奶牛妊娠后期至泌乳初期(产前21 d至产后21 d)称为围产期[8]。围产期奶牛的内分泌和代谢水平发生变化，当饲喂日粮能量不足或产奶量增多，造成营养供应无法满足产奶的能量需求时，最容易发生能量负平衡(Negative energy balance，NEB)[9]。机体为了适应这种变化会通过生理调节机制来补充营养供给，例如进行脂肪动员，从而产生大量游离脂肪酸和酮体，导致酮病的发生[10]。奶牛产前摄入能量过高导致过度肥胖，大量脂肪沉积肝脏，肝功能受到影响，当产后脂肪动员增加时肝脏无法将大量游离脂肪酸代谢掉，酮体就在血液、尿液和乳中异常累积，引发Ⅱ型酮病[11]。因此，糖异生减少、脂肪动员、肝脏脂质沉积、酮体生成增多就是围产期奶牛出现酮病和脂肪肝的主要发病机制[12]。

临床上主要根据血酮指标、血液葡萄糖浓度、肝酶指标结合发病时期综合进行酮病诊断。ALT和AST是实验室常用肝脏检查指标，其中AST主要存在于肝细胞线粒体内，常用于反映肝细胞损伤。郭仕辉等[13]对Ⅱ型酮病奶牛进行血液生化指标检测后发现酮病牛AST显著升高，与本试验结果相似，然而在杨威等[14]的研究中患酮病的奶牛并未出现AST升高，仅靠肝指标来判断肝脏功能敏感性不够高。

本报告首次对奶牛采用肝脏活检技术辅助诊断Ⅱ型酮病，对于脂肪肝的检测敏感性高、特异性强，并且能够直接对活检肝脏组织进行甘油三酯测定，比血清甘油三酯指标检测更加敏感。肝脏活检创口较小、操作简便，在人医中得到广泛应用，Lofstedt等[15]对马进行肝脏活检以检测马结核病，国内目前也开始将此技术用于犬猫肝脏疾病的临床检测[16]，但未见奶牛肝脏活检的相关报道。肝脏活检可直接对肝脏组织制作病理切片判断肝细胞以及肝脏组织损伤程度，评估肝脏功能，能够准确对疾病做出诊断，为后期治疗提供指导，并辅助判断预后。因此，肝脏活检技术可作为奶牛Ⅱ型酮病伴发脂肪肝的辅助诊断方法。

该奶牛场在进行药物治疗后泌乳奶牛酮病未见明显好转，由于围产期饲养管理不善，奶牛过度肥胖出现脂肪肝，围产期奶牛干物质采食量减少，脂肪动员增加，导致酮体异常累积，肝功能受损，无法为正常代谢提供能量，从而继续增加脂肪动员，形成恶性循环。另外，肥胖奶牛还容易出现胰岛素抗性，这也是导致II型酮病对治疗反应不佳、预后不良的主要原因之一[17]。因此，必须强化饲养管理，合理调整日粮结构，定期对围产期奶牛进行酮病检测。严格控制集约化养殖奶牛的体重，防止奶牛过肥，控制营养摄入，并在奶牛的泌乳期根据产奶量科学调整日粮中蛋白质(8%～10%)、粗饲料(>19%)、维生素、矿物质元素的比重，保障营养均衡[18]。在增加营养的过程中，勿轻易更换饲料配方，以防因适口性变化导致奶牛食欲下降。奶牛场需做好饲养管理，注意日粮的科学配比，预防酮病的发生，出现病情尽早干预，降低奶牛酮病的发病率，提高奶牛养殖的经济效益。