实时荧光定量PCR及新型冠状病毒的检测鉴定

王柯

（浙江中医药大学，浙江杭州 310053）

通过在PCR反应的体系中加入了荧光基团，接着利用荧光信号的累积实时监测整个PCR的进程，最终通过标准曲线对未知模板进行定量分析的技术方法，就是实时定量PCR技术。由于常规PCR技术在应用过程中暴露出了许多问题，如假阳性的弊端、造成环境污染问题等，这些问题将会限制了PCR技术在临床的进一步应用[1]。与常规PCR相比，它更加准确、特异、灵敏和快速，所以短时间内就被广泛应用到医学、农业等多个领域。本文将具体阐述实时荧光定量PCR及初步说明检测鉴定新型冠状病毒中的作用。

1. 实时荧光定量PCR的简要介绍

1.1 TaqMan探针

TaqMan探针为一寡核苷酸，在其两端分别用一个报告荧光基团以及一个淬灭荧光基团进行标记。当探针完整的时候，淬灭基团吸收报告基团所发射的荧光信号。进行延伸反应时，探针会被聚合酶的5′-3′外切酶活性切断，使得荧光基团与淬灭基团分离开，继而能够发射出荧光。一分子的产物的产生，同时也就伴随着一分子的荧光信号产生，随着扩增循环的数目不断增加叠加，所释放出来的荧光基团也不断积累并增加，最后我们根据荧光强度可定量分析。新型TaqMan-MGB探针，其3′端标记的荧光淬灭基团是一种几乎无荧光本底的小沟结合物，使其特异性、灵敏度、稳定性都有所提高。该技术既可进行基因定量分析，又可以应用于单核苷酸多态性检测（SNP）和多重病原体检测等领域。

1.2 SYBR荧光染料

荧光染料的检测方法是非特异性检测的一种方法，PCR反应体系中的总核酸量通过此方法能够被反应，主要包括溴化乙锭、SYBR GreenⅠ等。当荧光染料与双链DNA结合之后，其荧光将增强，但是没有掺入链中的SYBR染料分子不会放射任何的荧光信号，因此荧光的增强程度与复制的进行是同步关联的。SYBR荧光染料的优越性体现在操作简单、灵敏性高、通用性强、经济等方面。只要测定PCR反应液中的荧光强度，就可以对目标基因进行定量分析，目标基因的Tm值也可以通过此方法测定出来。在使用过程中需把握荧光染料的浓度，若浓度过低，扩增的样品可能无法检出。若浓度过高，SYBR GreenⅠ则又可以抑制PCR反应，进而降低PCR反应速率，可以采取合适的Mg2+浓度来对抗它对反应的抑制作用。

1.3 分子信标

分子信标带有茎环结构，是一种双标记寡核苷酸探针，也是一种TaqMan探针的衍生形式。由于其两侧的核酸序列是互补配对的，会导致荧光基团与淬灭基团相互贴近，因而无法产生荧光。但在退火进程中，分子信标中间的部分会与特定的DNA序列进行配对并结合，使得荧光基因与淬灭基因相分离产生荧光。分子信标的灵敏度高、操作简便，被用于生物学和生物分析等领域，对基因突变所引起的疾病、活细胞RNA及蛋白质的检测发挥着很大作用。

分子信标的灵敏度要比其他同长的寡核苷酸探针高，它适用于检测点突变，仅有一个核苷酸差别的DNA序列也能得到区分，其弊端在于与模板结合的稳定性较差。从分子信标首次提出以来，它在很多重要的生化分析领域中扮演着越来越重要的角色[2]。

2. 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）及检测方法

2.1 SARS-CoV-2的及其特点

2019年12月，新型冠状病毒在武汉城爆发，该病毒的所致症状通常为发烧、乏力、干咳等，逐渐发展为呼吸困难，严重者表现为ARDS，甚至脓毒症休克，以及难以恢复的代谢性酸中毒还有凝血功能的障碍，其传播途径为呼吸道飞沫传播和接触传播。该病毒因其危害性大且传染性强，有潜伏期，没有相关特异的治疗方法，目前新型冠状病毒肺炎在全世界范围内蔓延。

新型冠状病毒是引起此次新型冠状病毒肺炎的病原体，属于β属冠状病毒，其基因组为单链RNA。新冠肺炎疫情传播非常迅速，感染面很广，防控的难度很大。但是目前我们对于新型冠状病毒的来源还不是非常确定，存在着诸多争议。SARS-CoV-2还有很多的变异株，如奥密克戎等，其快速的变异性更是对控制新冠起了巨大的阻碍作用。

2.2 SARS-CoV-2的检测

检测SARS-CoV-2的特异核酸序列，首先要将SARSCoV-2核酸（RNA）逆转录为DNA，再用多聚酶链反应的方法将DNA进行扩增，用来检测特定的基因序列。PCR是扩增DNA的方法，是将筛选出的具有特异性的新冠病毒部分特有的相关基因片段作为靶标DNA，这种序列的扩增是是一种指数级的扩增。每一个新扩增出来的DNA序列，我们都可预先就加入的一段荧光标记得探针结合，用于产生荧光信号。扩增过程中扩增出来的基因愈多，累计的荧光信号就越强，以此方法可以确定样本中是否有病毒的核酸，也就是表示受检者是否感染[3]。

国家卫生健康委办公厅关于印发《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》和《新型冠状病毒肺炎防控方案》中指出，荧光定量逆转录PCR可以快速检测病人标本中的SARSCoV-2 RNA[4]。其步骤包括标本采集、试剂与仪器准备、提取RNA、RT-q PCR等。

确诊感染的最重要指标之一是进行新型冠状病毒核酸的检测，如何确保检测的精准性是实验室目前的重点。诊断试剂、核酸检测质量体系是较令人注意的内容，在标本取材的方面质量控制通过“内标”RNase P的设置是一种较好监控是否采集到足够量的细胞的方法。但是核酸RNA在取材后的降解这方面却容易被忽略，也是由于各式各样的取材管，无统一的标准与要求，后期的核酸检测结果就容易出现假阴性的现象[5]。

在RT-PCR的实验过程中，为防止阳性核酸的污染，进行试剂配制、核酸抽提、核酸扩增等需要进行分区处置。并将阳性结果进行复测，或在核酸重新抽提后复测，因此在检测的过程中，建议加入dUTP以及UNG酶的防污染系统[6]。

传统当中的实时荧光定量RT-PCR的检测方法需要进行加样、核酸提取、离心等生物安全风险系数较大的步骤，同时在新冠病毒核酸的检测在样品的保存等实验内容、实验室中人员操作的熟练程度、生物安全意识等方面有着较高需求。目前随着分子诊断内容的广泛开展，其核酸提取扩增检测一体化的实时荧光定量PCR仪不断在临床中得到应用[7]。

2.3 数字PCR

现在运用广泛的荧光定量PCR（RT-PCR）在检测SARS-CoV-2方面可能会存在“假阴性”的结果，存在需要多次取样、重复检测等缺陷，因此亟需建立一种灵敏度更高、样本用量更少、操作更简单的检测方法，以快速、精确的方式筛查出患者。数字PCR作为一种新兴的痕量核酸分子技术，它不仅有灵敏度高、耐受性强的特点，也拥有可以绝对定量等优点，在病毒检测的领域中受到广泛应用。同时，数字PCR对反应抑制剂的耐受性比较强、受到背景野生DNA分子干扰小，当样本珍贵、病毒载量低、样本核酸存在降解时，数字PCR优势明显。迅速、便捷、准确地监测环境中的病毒也是数字PCR的一大特点，早发现、早隔离、早治疗，对维护全球公共卫生安全具有显著的深远影响[8]。

然而我国的数字PCR技术存在着诸多弊端，例如缺乏共性理论的研究，与数字PCR方法的发展实际联系不够贴近。若要应用于临床研究，数字PCR方法尚未获得监管部门许可，这也许是造成医疗卫生等范畴无任何有关标准的主要原因。我国数字PCR方法与标准的国际化存在一定的差距，原因是未引起对其国际标准化的重视[9]。

2.4 病毒基因测序

基因测序作为一种新型的基因检测技术，它能够通过血液或唾液分析测定基因序列，从而预测病毒感染等疾病的可能性，根据与已知的新型冠状病毒是否高度同源，进而判断是否感染新冠病毒。

2.5 存在问题与对策

新冠的标本在采集完成后如果存在标本盖没有拧紧或者由于倾倒转输的过程中经过剧烈震荡摇晃的情况也可以造成交叉污染。正因如此，在日常工作当中就应该制订有关标本采集的相关标准操作程序，加强对相关人员的系统培训与考核，确保标本在采集、运输、保存等各个途径中都没有被污染的可能性。核酸检测也需要在符合生物安全的实验室进行，所有设备例如生物安全柜、离心机等，若被阳性质粒或阳性标本所污染，就可以导致假阳性的结果出现，仪器的性能如果不佳也会造成扩增出现假阳性。除此之外，实验室的污染、核酸检测的人员防护意识以及防污染的意识不够强，或者其对实验标准操作的规程不熟悉，也容易导致污染，最终使结果出现假阳性的情况[10]。

RT-PCR的检测的可信度比较高，但在最开始也存在假阴性的问题。实际上核酸检测呈现假阴性的原因有：研发的试剂盒质量并不是很高，经过改进以后，这一方面的短板得以解决，患者在做前几次检测时，病毒也许没有充分侵入人体。所以说，有人经多次检测才查出病毒核酸阳性的结果[3]。其解决方法有：标本采集进行标准化培训，并且提高试剂盒的质量控制，增加检测明确性质，对出院患者进行密切随访等。核酸检测假阴性的情况同样需要被重视，所以必须重视轻症患者的出院标准，同时提高治愈出院的标准[11]。

2.6 展望

对SARS-CoV-2核酸的RT-PCR检测，以及利用病毒基因测序与已知的新型冠状病毒高度同源等方法途径作为临床确诊的主要判断依据，防控疫情取得了较好的效果[12]。PCR的荧光定量PCR、数字PCR等诊断技术各有其优劣之处，因此它们适用于不同的条件。在目前实时荧光定量PCR的发展是较为完善的，在临床检测中适用面较广泛。在医院、第三方检测机构等场所，荧光定量PCR是SARS-CoV-2检测的主要手段，然而其检测效率会被假阴性所制约，检出率不高。数字PCR可以定量检测病毒的拷贝数目，且灵敏度要高于荧光定量PCR，对于恢复期患者低病毒载量的上呼吸道的样本，数字PCR仍可以检出SARS-CoV-2，但其检测的成本高，且操作相对繁杂，难以普及[13]。

本土疫情已基本得到控制，但由于境外疫情的发展以及国内局部地区新冠疫情时有发生，面临着新冠肺炎输入疫情的境地与存在着疫情反弹的风险，面临恢复正常生产需求、生活秩序的迫切需要等问题，新冠疫情防控的形势依然十分严峻[14]，全球新冠肺炎疫情以及连带效应，给全世界的人民带来的是多重危机。为了有效面对并战胜疫情所带来的危机，构建人类命运共同体的迫切性与重要性更加能够得到凸显[15]。其诊断方法依然是当下的研究的重中之重，我们仍需要高特异性和灵敏度、低成本易操作且时间短的诊断方法。相信随着不断的深入研究，新型可靠的诊断技术将不断满足临床当中的需求，更好地为患者生命得健康保驾护航[12]。