ID-UPLC-MS/MS检测大鼠尿液DNA氧化标志物8-oxodGuo方法的建立*

黄 斌，赵素玉，林董莉，吴琼碧，吴仙军，张 伟，叶玲燕，梅益斌

(浙江省丽水市人民医院心血管内科 323000)

氧化应激最早源于对衰老的认识，因自由基伤害并不是造成老化的唯一因素，所以在1990年美国衰老研究权威专家Sohal教授指出了自由基存在的缺陷，并首次提出了氧化应激。氧化应激是指高活性分子如活性氧(reactive oxygen species,ROS)等诱导复杂反应体系中重要生物分子发生氧化修饰，当不断产生的氧化产物超出了机体的清除能力，就会使得氧化和抗氧化系统失衡，最终导致组织损伤。氧化应激过程中产生的ROS、自由基等可引起许多生物大分子如核酸、蛋白质及脂质的氧化损伤，而核酸的氧化损伤相对来说较为重要。核酸的氧化损伤可分为直接氧化损伤和间接氧化损伤，直接氧化损伤是核酸上的碱基发生氧化，间接的氧化损伤是指核苷酸池中的原始核苷酸上碱基发生氧化损伤[1]。

每个细胞正常代谢所产生的ROS、自由基每天可修饰大约10 000个碱基，AMES等[2]认为即使生物体具备完善的氧化修复机制，也会有少量损伤的碱基因为得不到充分修复而发生损伤积累。脱氧核糖核酸(deoxyribo nucleic acid，DNA)氧化损伤与多种疾病密切相关，如慢性肝炎[3]、非小细胞肺癌[4]、青光眼[5-6]、慢性阻塞性肺病[7]、甲状腺疾病[8]、冠心病[9-11]、房颤[12]等，而DNA氧化损伤多种产物中，8-羟基脱氧鸟苷(8-oxo-7,8-dihydro-2-deoxyguanosine，8-oxodGuo)是国际公认的DNA氧化损伤敏感的生物标志物。

相较于酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、高效液相色谱电化学检测(high performance liquid chromatography electrochemical detectors，HPLC-ECD)、气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)和液相色谱质谱联用(liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS)方法，超高效液相色谱-串联质谱(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)检测方法因其分离快速、检测灵敏度高等优势，已被广泛应用于DNA氧化损伤产物的检测。但已建立的尿液8-oxodGuo UPLC-MS/MS检测方法[13-14]，样本处理流程烦琐，应用固相萃取柱费用昂贵，检测时间也较长，本研究引入了同位素内标，建立了一种干扰小，灵敏度高，线性佳，分析快速、准确的UPLC-MS/MS检测方法(ID-UPLC-MS/MS)，可较好地应用于评价氧化应激所导致的DNA氧化损伤。

1 材料与方法

1.1 试剂

8-oxodGuo(纯度大于98%)购于美国Sigma-Aldrich 公司；[15N5]8-oxodGuo(纯度大于98%)购于美国Cambridge Isotope Laboratories 公司；甲酸(HPLC级)购于德国Merck公司；醋酸铵、甲醇(HPLC级)购于美国Fisher Scientific公司。蒸馏水为屈臣氏蒸馏水。

1.2 仪器

质谱仪：Agilent 6490 Triple Quad MS/MS 三重四极杆质谱仪；超高效液相：Agilent UPLC 1290 超高效液相系统；色谱柱：SB-Aq,3.0 mm×100.0 mm,1.8 μm,600 Bar，以上均为美国Agilent公司产品； -80 ℃超低温冰箱 (日本Revco公司)；MilliQ Plus 超纯水机 (美国Milliporegong公司)；520A 型pH 计 (美国Orion公司)；120S型电子分析天平(德国Sartorius公司)；Beckman 22R型台式低温高速离心机(美国Beckman-Coulter公司)。

1.3 溶液配制

(1)配置10 mol/L醋酸铵：称38.5g醋酸铵溶于50 mL屈臣氏蒸馏水中，混匀；(2)配制10 mmol/L的醋酸铵：取10 mol/L醋酸铵1 mL用屈臣氏蒸馏水稀释到1 L，混匀，再调pH=3.7；(3)配制5 mmol/L的醋酸铵(含0.1%甲酸)：取10 mol/L醋酸铵0.5 mL用屈臣氏蒸馏水稀释到1 L，再加入甲酸1 mL，混匀；(4)工作液：用10 mmol/L的醋酸铵(pH=3.7)配制30%的甲醇溶液。

1.4 液相及质谱条件

(1) 液相条件:水相(A)为5 mmol/L的醋酸铵(含0.1%甲酸，pH=3.7)，有机相(B)为甲醇；平衡时间1 min；进样体积5 μL；针位0 mm；柱温箱温度35 ℃；梯度洗脱条件见表1。(2) 质谱条件：离子源为Jet Stream ESI源；离子扫描模式为动态多反应监测正离子扫描模式(Dynamic MRM)；干燥气温度为200 ℃；干燥气流量为16 L/min；雾化气压力为30 psi；鞘气温度为400 ℃；鞘气流量12 L/min；毛细管电压2 000 V；喷嘴电压0 V；具体离子对信息见表2。

表1 尿液8-oxodGuo液相梯度洗脱

表2 目标化合物离子对参数

1.5 样本收集

SD大鼠购于中国科学院上海实验动物中心，饲养在温州医科大学SPF级动物房中，温度可控、12 h昼夜交替。动物可自由饮水及进食，全部实验操作依照国家卫生研究院实验动物保护及使用指南执行。将3月龄大鼠放置于代谢笼中，收集24 h尿样，经过8 000×g 3 min离心后，分装于1.5 mL高压灭菌离心管中，并储存于-80 ℃直至被分析。

1.6 样品处理

取200 μL大鼠尿液置于 1.5 mL 高压灭菌离心管中，加入200 μL工作液，再加入480 ng/mL的同位素内标和屈臣氏蒸馏水各10 μL，涡旋仪上涡旋混匀2 min，后置于37 ℃生化培养箱10 min，再于4 ℃ 12 000×g离心15 min，取上清液100 μL加入到进样瓶内的一次性内插管中，UPLC-MS/MS进样5 μL直接检测或-80 ℃冻存待测。

2 结 果

2.1 实验溶剂及流动相质谱全扫图

为防止实验溶剂及流动相对检测结果造成影响，本研究对所用实验溶剂和流动相进行了质谱全扫，见图1。由图1可见屈臣氏蒸馏水，流动相水相5 mmol的醋酸铵(含0.1%甲酸，pH 3.7)及有机溶剂甲醇(含0.1%甲酸)对8-oxodGuo的质荷比(mass-to-charge ratio，m/z)分别为284/168和284/140，其对[15N5]8-oxodGuo的m/z 289/173的影响可忽略不计。

A：屈臣氏蒸馏水；B：流动相水相；C：甲醇(含0.1%甲酸)。

2.2 DNA氧化损伤标志物8-oxodGuo的色谱图

8-oxodGuo及其内标的出峰时间在第3.75 min，为减少背景噪音对分析物的影响，故大致将2.5 min前及4.0 min后洗脱出的非目标分析物直接排入废液，只分析2.5～4.0 min间洗脱出的8-oxodGuo及其内标。8-oxodGuo及其同位素内标峰形对称，出峰位置干扰少，见图2。

2.3 检测方法的评价

2.3.1线性关系

本文所建立的ID-UPLC-MS/MS检测方法的最低检测限为0.2 pg(信噪比=10)，在0.4～100.0 ng/mL线性范围内线性关系良好，回归方程为Y=0.051 3X-0.022 4，相关系数为r=0.999 6。X为检测物峰面积/内标峰面积，Y为检测物浓度。

2.3.2回收率和精密度

通过在已知8-oxodGuo浓度的大鼠尿液100 μL中分别加入低、中、高3种不同浓度(0.4、10、100 ng/mL)的 8-oxodGuo标准品100 μL，经过样本处理流程及ID-UPLC-MS/MS检测，所得的回收率及精密度见表3。

2.4 大鼠尿液样本DNA氧化损伤标志物8-oxodGuo水平

3月龄大鼠尿液中DNA氧化损伤产物8-oxodGuo的浓度在4.88～6.66 ng/mL范围内检测的5只大鼠尿液8-oxodGuo浓度分别为5.36、4.88、6.66、6.51、5.93 ng/mL。

A：样本；B：标准品(10 ng/mL)；C：样本+标准品(2 ng/mL)。

表3 8-oxodGuo低、中、高浓度回收率及精密度

3 讨 论

当前， ELISA[15-16]、HPLC-ECD[17-18]，GC-MS[19-20]和LC-MS[21-25]已经被广泛应用于DNA氧化鸟苷的检测。然而ELISA常常存在较大的背景干扰和非特异性染色，HPLC-ECD对ECD要求相对较高，GC-MS在气化过程中可能有较严重的自动氧化，LC-MS相对分离时间较长。已建立的尿液8-oxodGuo UPLC-MS/MS检测方法[13-14]，样本处理流程相对烦琐，应用固相萃取柱费用昂贵，检测时间也较长，而本研究建立的ID-UPLC-MS/MS检测方法干扰小，灵敏度高，线性佳，分析快速、准确，并进行了方法学验证。

本研究建立ID-UPLC-MS/MS检测方法使用甲醇作为流动相的有机相，虽然甲醇的洗脱能力较乙腈弱，但对8-oxodGuo的响应比乙腈快，这可能与甲醇的离子化能力较强相关，而且尿样相对较脏，受干扰也较大，若响应不够快，则检测结果将有所损失。若尿液前期处理方法不适当， 8-oxodGuo的检测结果将受影响，同时低浓度的回收率波动较大，标准偏差值也相对较大，因此在绝对进样量相同情况下，低浓度大进样体积的结果不如高浓度低进样体积的结果稳定。虽然当前研究样本处理流程相对简单，但相较于用纯甲醇、纯乙腈、与甲醇或乙腈不同比例混合的10 mmol/L的醋酸铵混合液进行的样本处理比较，本研究的处理方法8-oxodGuo响应相对较快。

当前多项研究证实DNA氧化在多种疾病如职业暴露疾病、糖尿病肾病、肿瘤、男性不育、心血管疾病、儿童相关疾病等中发挥了重要作用[4,7-9,12,17]。尿液作为机体代谢物的集中池，因其无侵入性，收集方便，易被患者所接受，因此尿液中DNA氧化损伤的生物标志物8-oxodGuo在未来将很可能被广泛用于疾病的监测，本研究建立的UPLC-MS/MS检测方法将有助于完善其对疾病的监测。