宁夏中南部地区牛支原体病原学检测及分离鉴定

马 林，周海宁，杨佳冰，马 龙，闵 泽，魏凡华，李知新

（1.宁夏大学农学院，宁夏银川 750021；2.宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心，宁夏银川 750011）

牛支原体（Mycoplasma bovis）可引起牛的肺炎、关节炎、乳房炎、生殖道炎症以及流产、不孕等症状[1]。自1961 年美国从患有乳房炎的病牛中成功分离出支原体病原后[2]，牛支原体感染病例在很多国家被发现并报道。我国在1983 年首次从患有乳房炎奶牛产的牛乳中分离出支原体[3]，2008年在湖北省发现牛支原体感染病例，且成功分离出牛支原体菌株，此后在多地发现牛支原体感染病例[4-5]。2021 年6 月，宁夏中南部西吉、彭阳、隆德、同心等多地发现以发热、咳嗽、流鼻涕、肺部坏死为典型症状的病牛，对当地肉牛的健康造成了很大的威胁[6-7]，初步怀疑此区域存在牛支原体感染。为进一步了解宁夏中南部地区牛支原体感染情况及流行菌株耐药性，本试验采集宁夏中南部9 个县区牛鼻拭子样品开展牛支原体调查，以期为宁夏中南部地区牛支原体病防控和临床用药提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源 2021 年6—10 月，选取宁夏中南部地区曾报道过牛支原体病临床症状的9 个县区（西吉县、隆德县、彭阳县、泾源县、原州区、沙坡头区、海原县、中宁县、同心县）27 个肉牛规模养殖场、9 个肉牛屠宰场、9 个牛羊交易市场，随机采集牛鼻拭子样本共495 份，低温运送至实验室，4 ℃保存待检。

1.1.2 主要试剂 PPLO 肉汤，购自青岛海博生物有限公司；葡萄糖，购自天津科密欧化学试剂公司；马血清，购自德宁生物公司；青霉素，购自江西科达公司；琼脂、酵母粉，均购自美国BD 公司；苯酚红、丙酮酸钠，购自北京索莱宝公司；MEM（10×），购自美国赛默飞公司；细菌专用核酸提取试剂盒，购自北京天根生化公司；DL 2 000 DNA Marker，购自北京全式金生物有限公司；药敏片，购自杭州滨河微生物试剂有限公司。

1.1.3 主要仪器 超净工作台，南通嘉程JC-2-1；核酸提取仪，西安天隆科技NP968S；高速离心机，德国艾本德5427R；二氧化碳培养箱，上海力申HF90；振荡培养箱，金坛亿通BS-IE；生物显微镜，德国麦克奥迪SK2002ZP；电泳仪，北京六一DYYCP-31C；紫外凝胶成像仪，美国伯乐VnirerallHood Ⅱ。

1.2 方法

1.2.1 培养基配制 PPLO 液体培养基400 mL：葡萄糖2.0 g、PPLO 粉 8.4 g、酵母粉2.0 g，加三蒸水定容至360 mL，充分搅拌使各组分溶解，然后121 ℃ 20 min 高压灭菌；降温至50～70 ℃时取出，加入马血清40 mL、10%精氨酸4 mL、10×MEM 4 mL、8 万单位青霉素（过滤）4 mL、1%酚红溶液400 μL。PPLO 固体培养基：葡萄糖0.5 g、PPLO 肉粉10.5 g、琼脂粉5.0 g、25%酵母浸液2.5 mL，0.4%酚红溶液2.5 mL，加三蒸水定容至400 mL，用1 mol/L NaOH 调节pH 至7.6～7.8，121 ℃ 20 min 高压灭菌处理，50～70 ℃时取出，加入马血清100 mL，丙酮酸钠 0.5 g，8 万单位青霉素（过滤）5 mL。

1.2.2 引物合成 参照文献[8] 设计合成1对支原体16S rRNA 通用引物和1 对牛支原体oppF基因特异性引物用于牛支原体扩增。P1 上：5'-AACTGCTGTGGTTAGGGAAG-3'；P1 下：5'-ACTGAGAACGGTTTTTTGAG-3'。预计扩增目的片段为858 bp。P2 上：5'-TAACATTAGTGTTGTCGCTA-3'；P2 下：5'-TTAATCTTTTTAAACTTGAG-3'。预计扩增目的片段为1 914 bp。引物由安徽通用生物技术有限公司合成。

1.2.3 PCR 检测 使用细菌专用核酸提取试剂盒提取的样本DNA 作为模板用于PCR 扩增，所用引物为支原体16S rRNA 通用引物P1（目标片段858 bp）和牛支原体oppF基因特异性引物P2（目标片段1 914 bp）。采用25.0 μL 扩增体系（表1），同时设立阳性、阴性对照组 。P1 反应条件：94 ℃5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 10 min；P2 反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 10 min。PCR 产物于1%的琼脂糖凝胶进行电泳后，使用紫外凝胶成像仪分析。

表1 PCR 扩增体系 单位：μL

1.2.4 支原体分离培养与鉴定 无菌条件下，将PCR 鉴定为阳性的鼻拭子样本，接种于液体培养基，置于37.5 ℃振荡培养箱培养3～7 d，观察液体颜色从红色变为澄亮透明的黄色，吸取1.5 mL 菌液，提取DNA 后再次进行PCR 检测；将PCR 检测结果呈阳性的菌液接种于牛支原体固体培养基，置于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养3～7 d 后观察是否有“煎蛋样”菌落形态，挑取疑似菌体于固体培养基反复传代3～5 次，直至培养出牛支原体纯菌株。

1.2.5 支原体药敏试验 参考文献[9]的操作方法，选取卡那霉素、苯唑西林、链霉素、恩诺沙星、环丙沙星、多黏菌素B、泰乐菌素、泰妙菌素、哌拉西林、林可霉素、庆大霉素、土霉素、四环素、头孢唑林、阿莫西林、氨苄西林等16 种药敏片进行支原体耐药性检测。敏感性、耐药性的判定标准参考文献[10]。

2 结果与分析

2.1 感染情况调查

用支原体16S rRNA 通用引物P1 对所有样本进行PCR 检测，结果在495 份样本中检出阳性59份，总体阳性率为11.92%，9 个县区的牛支原体阳性率为1.82%～21.82%（表2），其中同心县阳性率最高，为21.82%；其次为泾源县，阳性率为20.00%；隆德县阳性率最低，为1.82%。场点阳性率最高的是屠宰场，阳性率为13.33%，最低的是规模场，为11.11%，3 种场点之间的阳性率差异不显著（表3）。

表2 各县（区）不同场点鼻拭子样本PCR 检测结果

表3 不同场点鼻拭子样本牛支原体PCR 检测结果

2.2 牛支原体分离培养

将检测结果为牛支原体阳性的鼻拭子，使用液体培养基培养3～7 d，传3 代后，液体培养基由红变黄（图1-A），固体培养基上出现肉眼可见的“针尖样”大小的无色透明菌落（图1-B），用40×显微镜观察固体培养基有“油煎蛋样”菌落形成（图1-C），吉姆萨染色后成不规则状（图1-D）。59份PCR 检测阳性样本中，共分离出16 株疑似牛支原体菌株。

2.3 牛支原体菌株PCR 鉴定

使用支原体16S rRNA 通用引物，将16 份疑似牛支原体分离培养物进行PCR 扩增。结果（图2～3）显示：4 个分离株的扩增产物均出现预期扩增片段858 bp，进一步使用牛支原体oppF基因特异性引物扩增，4 个分离株均得到约1 914 bp 的目标片段。将支原体16S rRNA 通用引物扩增的核酸产物进行测序比对，结果发现4 个分离株序列与国际标准株PG45（GenBank 登录号CP002188.1）的同源性均在99%以上，与重庆菌株CQ-70W（GenBank 登录号CP005933.1）、新疆菌株XJ-1（GenBank 登录号MW295534.1）、湖北菌株HB0801（GenBank 登录号 CP007589.1）、宁夏菌株Ningxia-1（GenBank 登录号CP023663.1）的同源性皆在97%以上，说明分离培养的4 株菌株（NZ-1、NZ-2、NZ-3、NZ-4）均为牛支原体。对所分离的4 株牛支原体16S rRNA 序列与支原体代表菌株通过MAGAX64 软件进行序列比对分析，用N-J 法建立系统发育树，结果发现分离的4 株牛支原体菌株均与宁夏菌株Ningxia-1、国际标准菌株PG45 亲缘关系最近（图4），与支原体16S rRNA 通用引物P1、牛支原体特异性引物P2 扩增结果一致。

2.4 药敏试验

结果（表3）显示：从牛鼻拭子中分离的牛支原体对卡那霉素、恩诺沙星、泰妙菌素、林可霉素、庆大霉素、土霉素高度敏感，而对泰乐菌素、四环素中度敏感，对苯唑西林、链霉素、环丙沙星、多黏菌素B、阿莫西林、哌拉西林、头孢唑林、氨苄西林不敏感。

表4 药敏试验结果 单位：mm

3 讨论

牛支原体病传播速度快，且无针对性药物、疫苗进行治疗和预防，严重威胁我国的肉牛养殖业健康发展。据国外相关报道[11]，英国曾对牛支原体进行血清学检测，结果发现牛支原体场群抗体阳性率为50%。2019 年赵金玉[12]等采用PCR 检测方法，对新疆地区牛支原体进行检测，发现总体阳性率为22.6%。2019 年徐引弟等[13]对河南省屠宰场350 份肺脏组织采用PCR 方法进行牛支原体检测，结果发现屠宰场阳性率为4.68%。2009 年王晓亮等[14]对宁夏从牛支原体病疫区引进牛、疫区原有牛，分别采集298 份、197 份牛血清进行检测，结果发现疫区引进牛抗体阳性率为84.6%，疫区原有牛抗体阳性率为38.6%。2016 年郭亚男等[15]对宁夏22个县区660份牛血清进行牛支原体检测，发现牛支原体抗体阳性率为19.24%。可见，牛支原体在国内外普遍流行。在已有的国内报道[12-16]中，采用PCR 诊断方法进行分子流行病学调查检出的支原体阳性率为4.68%～34.22%。本试验发现，宁夏中南部9 个地区的牛支原体总体阳性率为11.92%，其中规模场、屠宰场、交易市场阳性率分别为11.11%、13.33%、12.59%，与国内地区关于牛支原体感染情况调查的结果基本一致，说明牛支原体在宁夏中南部地区流行率也较高，且规模场、屠宰场、交易市场等场点均有不同程度感染。国内对牛支原体感染情况的调查多为血清学抗体检测，而本试验采用分子生物学诊断方法进行牛支原体感染情况调查，针对性较强，调查成本低。本试验成功从牛鼻拭子样品中分离获得4 株牛支原体，与相关报道[17]结果相符，再次验证了牛鼻拭子可以成功分离培养出牛支原体。

试验使用牛支原体oppF基因特异性引物，对4株分离株进行PCR 鉴定，均扩增出大小为1 914 bp的目的片段。经16S rRNA 基因序列同源性分析及遗传进化分析发现，分离株与国际标准株PG45 同源性超过99.0%，与国内重庆株、湖北株、新疆株、宁夏株同源性均高于97.0%，与国际标准株PG45、宁夏菌株Ningxia-1 亲缘关系最近。此方法的利用以及鉴定结果与2013 年郭澎强[18]等关于宁夏银川地区牛支原体疾病诊断、2017 年杨铭伟等[19]对新疆南疆地区犊牛肺炎支原体的分离鉴定具有相似性，说明宁夏中南部地区流行的牛支原体未发生较大的基因变异。

当前，牛支原体病的治疗药物多为抗生素，但支原体对大多数抗生素具有耐药性，治疗效果不明显[8]。本研究对分离的牛支原体菌株进行药敏试验，结果发现分离株对卡那霉素、恩诺沙星、泰妙菌素、林可霉素、庆大霉素、土霉素高度敏感。因此，可结合实验室药敏试验结果进行针对性用药，而本试验结果可对宁夏中南部地区牛支原体病的临床用药提供参考。

综上建议，结合宁夏中南部地区牛支原体实际感染情况，继续进行牛支原体病原学监测及临床科学合理用药，加强引进牛群检疫及屠宰场管控，定期抽样调查，形成常态化监测，控制本病的流行和蔓延。