禽星状病毒研究进展

张富友，邓春冉，王素春，于晓慧，蒋文明，尹 馨，李金平，王楷宬，刘华雷，徐丽娜，李 阳

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056038）

禽星状病毒（avian astrovirus，AAstV）属于星状病毒科，包含多种亚型，是危害家禽养殖业的重要病原。AAstV 包括禽肾炎病毒（avian nephritis virus，ANV）、鸭星状病毒（duck astrovirus，DAstV）、鸡星状病毒（chicken astrovirus，CAstV）、鹅星状病毒（goose astrovirus，GoAstV）等，不仅影响家禽生产性能，还会引发雏鸡肾炎、鸭病毒性肝炎、腹泻、发育迟缓综合征和痛风等症状，同时具有感染人的潜在危害。近年来，AAstV 在全世界大范围流行，在我国也时有发生，如2017 年山东、江苏等多个地区暴发以新型GoAstV 为主要病原的雏鹅内脏型痛风病，估计造成的经济损失超过10 亿元[1]。此外，CAstV、DAstV-CPH 等新流行株的出现，也给该病防控带来较大挑战。本文围绕AAstV 病原学、流行病学、感染后临床症状、致病机制以及检测方法和控制措施等方面进行了阐述，以期为后续研究提供参考。

1 病原学

1.1 病毒分类

截止到2019 年，国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）将星状病毒科分成2 个病毒属，即哺乳动物星状病毒属（Mamastrovirus）和禽星状病毒属（Avastrovirus）[2]。AAstV 又分为3 个种（AAstV-1～3）7 个基因型，其中AAstV-1 包含火鸡星状病毒1型（TAstV-1），AAstV-2 包含禽肾炎病毒1 型（ANV-1）、2 型（ANV-2）、3 型（ANV-3）和CAstV，AAstV-3 包含火鸡星状病毒2 型（TAstV-2）、3 型（TAstV-3）和DAstV[3]。GoAstV、DAstVCPH 株和鸽源禽星状病毒等还未被明确分类。除此之外，有研究[4]根据CAstV 的衣壳蛋白基因序列差异，将其分为A 型和B 型，其中A 型可以分为A Ⅰ、A Ⅱ和A Ⅲ三个型，B 型可以分为B Ⅰ和B Ⅱ两个型。

1.2 病毒基因组结构

AAstV 是一种圆形、无囊膜的单股正链RNA病毒，直径25～35 nm，基因组全长6.1～7.9 kb[5]，包含两侧的5'和3'非编码区（UTR），3 个开放阅读框（ORF1a、ORF1b 和ORF2），1 个多聚核苷酸尾巴poly（A）。ORF1b 的下游与ORF1a 有一段12～45 nt 的重叠区域，该部分包含1 个茎环结构和核糖体移码信号（AAAAAC）[6]。ORF1a、ORF1b 分别编码丝氨酸蛋白酶和RNA 依赖性RNA 聚合酶（RdRp）[7]，ORF2 编码结构蛋白（衣壳蛋白前体）[8]。ORF2N 末端的415 个氨基酸高度保守，其余部分为多变区域[9-10]。ORF2 区域存在病毒中和抗原决定簇[11-12]，其编码的衣壳蛋白可能是病毒抗原性和细胞嗜性的主要决定因素，继而影响发病机制和致病性。星状病毒全基因组结构见图1[13]。

不同AAstV 的基因组存在一定差异。多数AAstV 的ORF1a 位于+1 读框，ORF1b 与ORF2位于+2 读框内，如火鸡星状病毒（TAstV）；禽肾炎星状病毒ORF2 与ORF1a 位于+1 读框，ORF1b 位于+2 读框；而鸭星状病毒1 型（DAstV-1）的ORF1a、ORF1b 与ORF2 分别位于不同的读框中[9，14-15]。TAstV-2、DAstV 等星状病毒衣壳蛋白N 端含有32～35 个碱性氨基酸，同时包含1 个保守的SRSRSRSRSR 基序，而TAstV-1 和ANV衣壳蛋白N 端的碱性氨基酸为23～25 个，但是不包含重复的SR 基序[16]。除TAstV-2 外，已知AAstV 的3'UTR 均含有一段高度保守的s2m序列，可以形成与病毒全基因组复制密切相关的茎环结构[17]。

2 流行病学

AAstV 分布广泛，宿主范围广，大部分禽类对其易感。AAstV 可通过污染的食物、水源或者工具等进行水平传播，也可从卵到子代进行垂直传播。在火鸡、珍珠鸡、鸭和水貂之间也存在星状病毒种间传播[14，18-19]。研究[20]显示，克罗地亚某农场30 日龄幼鸭和死胚中检测到ANV。另外研究[21]显示，AAstV 还存在传染给人的风险。在肯尼亚和冈比亚儿童粪便中检测到的星状病毒与ANV 序列同源性超过90%。此外，在参与调查的从事火鸡养殖屠宰等工作的人员中，约有26%表现为TAstV-2 血清抗体阳性[22]。

2.1 国外流行情况

DAstV 是最早被发现的AAstV。早在1965年，疑似DAstV 感染引发病毒性肝炎的案例就已被报道[23]。1983—1984 年，英国3 个鸭场发生了DAstV 引发的病毒性肝炎[24-25]。直到1985 年，该病毒才被定为鸭肝炎病毒2 型[24]，即DAstV-1。1969 年Toth 等[26]在死亡雏鸭的肝脏中发现了另一种鸭肝炎病毒（DHV），其引发的肝脏病变与其他已知的DHV 不完全相同，故将其定为鸭星状病毒3 型（DAstV-3）。在1975 年，该病例再次发生[27]。2009 年，Todd 等[28]将其定为鸭星状病毒2型（DAstV-2）。

ANV 最初于1976 年从雏鸡的肾细胞中被分离到，并被归类为微小核糖酸病毒[29]。直到2000年，其完整的基因组被克隆测序，序列分析发现ANV是星状病毒的一个新成员[30]。此后，ANV 在各地被陆续报道出来。2002—2005 年，匈牙利部分农场中4～22 日龄的鸡出现腹泻、发育迟缓综合征和间质性肾炎等症状，经反转录PCR（RT-PCR）检测发现接近70%农场的鸡群为ANV 核酸阳性[31]。2010 年，在澳大利亚同样症状的鸡群中也出现ANV 感染。2010—2016 年，研究者在巴西出现间质性肾炎症状的鸡群和火鸡群中检测到了ANV[32-35]。

1990 年，研究者利用电镜在鸡粪中发现了CAstV[36]。Smyth[37]于2004 年从患有发育迟缓综合征（RSS）的生长不均匀的肉鸡中发现了CAstV。2006 年，Pantin-Jackwood 等[38]从美国有生长发育问题的肉鸡中检测到CAstV。Oluwayelu 等[39]从尼日利亚鸡血清中发现CAstV 抗体，从而证实在非洲已经存在该病毒。Palomino-Tapia 等[40]于2014—2019 年从死胚和雏鸡的肝脏和肠道中检测到CAstV。2016 年，在印度的肉种鸡场，同样发现了CAstV[41]。

2.2 国内流行情况

2013 年，刘宁等[42]从刚出壳雏鸭中检测到DAstV-CPH 株，并从种蛋、雏鸭和成年鸭等样品中均检测到该毒株。2009 年，Fu 等[14]、Chen等[43]分别从某发病鸭场中分离到DAstV-1。2011年，研究人员在北京鸭粪便和肠道样品中也检测到DAstV[44]。2012—2014 年，Liu 等[45-46]陆续从发病的樱桃谷鸭和雏鸭中分离到DAstV-2 和DAstV-3。

Xue 等[47]从我国各地区鸡血清中检测到CAstV 抗体阳性，韩涛[48]等在我国各地区地方品种鸡的血清样品中检测到CAstV 抗体。Xue等[2]2016—2018 年从我国8 个省份AAstVs 抗体阳性鸡组织样本中分离到15 株AAstV-1 和27 株AAstV-2。

GAstV 在近几年被发现并得到人们重视。2014 年，多位研究者在我国不同省份的养鹅主产区发现GoAstV 感染的案例[49-52]，表明GoAstV 可能已波及多地。Chen 等[53]和Wei 等[54]从樱桃谷鸭中发现GoAstV，表明GoAstV存在种间感染情况。

3 临床症状及致病机理

AAstV 可感染多种家禽，引起禽类腹泻。在禽类中，星状病毒感染更多表现为肠道和其他内脏器官疾病，如间质性肾炎、鸭病毒性肝炎以及火鸡肠炎和火鸡腹泻等，从而引发各种不同的临床症状。AAstV 的致病机理仍不清楚，只有部分TAstV 引发肠炎的致病机制研究可作参考[55]。

CAstV 主要引发矮小、RSS、禽肠炎死亡率综合征、肾脏损伤、腹泻和“白雏鸡”疾病。RSS为一种生产性疾病，表现为雏鸡群体发育迟缓，体重增加不佳，这与因肠囊肿减少了养分的吸收而引发生长缓慢相吻合。CAstV 和其他肠道病毒同时感染后，会引起肠道环境异常，进而导致肠道菌群失调，自然定居菌失衡[56]。另一方面，CAstV 在鸡群中普遍存在并广泛传播，一定程度上可以被视为正常微生物系统的一部分在环境变化后，微生物系统发生变化，从而破坏了病毒的平衡，导致出现RSS 等情况[37]。通过CAstV 分离株人工攻毒试验发现，CAstV 可损伤雏鸡肠道，改变绒毛和隐窝的比例。“白雏鸡”病表现为一种孵化疾病，孵化出的小鸡羽毛苍白，虚弱矮小，不能长久存活，肾脏和肝脏受损伤，此外中后期胚胎死亡率和孵化率降低[57-59]。基因组对比分析显示，引发“白雏鸡”病的毒株在ORF2 区域高度相似，该疾病的严重性差异可能与基因组差异有关[60]。

DAstV 感染初期表现厌食、精神不佳，继而转为神经症状，表现运动失调、角弓反张[61]，剖检可见肝脏、肾脏等肿大，有出血性病变等[62]。GoAstV 感染则以痛风、肾脏肿大和出血为主要症状[51]。但是，人们对于DAstV 和GoAstV 的致病机制仍缺乏相关了解。

火鸡感染星状病毒后，主要表现为腹泻，但研究发现星状病毒并非因破坏肠上皮细胞或引发炎症而导致腹泻。目前，认为TAstV 感染火鸡并引发腹泻的方式有三种：一是TAstV 感染诱导钠吸收不良而腹泻[63]；二是TAstV 感染导致糖消化吸收障碍而腹泻[64-65]；三是因为TAstV 衣壳蛋白是一种肠毒素，可改变肠道屏障通透性和肠上皮细胞分布，进而引发腹泻[66]。此外，研究[67]表明，火鸡感染星状病毒后，自身免疫抑制因子TGF-β 活性得到增强，从而抑制了机体的炎症反应。

4 检测方法

4.1 电镜检测

电镜已被普及应用于某些动物病毒快速检测当中。尤其是在一些新发现的病毒检测中，该技术的优势更加突出。因为星状病毒特有的五角或六角星状特征，所以研究人员通过电镜从下痢的火鸡肠道中发现了星状病毒粒子[25，36，68]。此后一段时间内，电镜成为检测星状病毒的主要手段[69]。但是电镜检测过分依赖病毒特征，直接观察准确性低，适用于单个或少量样品。

4.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA 方法是一种免疫测定方法，利用抗原抗体结合对免疫反应进行定性或者定量分析。Herrmand 等[70]成功制备星状病毒单抗，并建立EIA 和ELISA 方法。荷兰BioChek 公司研制出针对CAstV B 群的ELISA 抗体检测试剂盒。Tang 等[71]利用ELISA 方法对两种血清型的TAstV 进行了交叉反应，证实了不同血清型的TAstV 具有相同的抗原。Wang 等[72]在大肠杆菌中表达了DAstV的ORF2 蛋白c 端，构建了间接ELISA 方法。Tang 等[73]建立了多克隆AC-ELISA 和单克隆ACELISA，前者具有更高的灵敏度和更宽的检测谱，后者特异性较高，但是灵敏度较低。Skibinska等[74]开发了用于检测鸡血清中CAstV 的间接ELISA 方法。

4.3 细胞培养和病毒分离

病毒分离培养是病毒研究中重要的一个环节，对毒株感染机制和发病机理等的深入研究以及疾病防治、疫苗和药物研究有重要意义。鸡胚或鸭胚接种、细胞培养是常用的病毒增殖方法。AAstV 不易在体外复制，目前使用鸡胚肾细胞（CEK）或鸡肝癌细胞系（LMH）可以实现AAstV 的分离，但是病毒增殖效率较低。Wei 等[75]利用LMH 细胞，从商品鸭中分离到新型GoAstV。Nunez 等[76-77]通过卵黄囊接种SPF 鸡胚，分离到CAstV 和ANV。Liu 等[78]将鸭组织样品接种到鸭胚的绒毛尿囊膜中，成功分离到DAstV-CPH 株。Zhang 等[79]通过鹅胚绒毛尿囊膜接种方式，从1 个养鹅场中分离到AAstV SD01 株。Patel 等[41]通过接种SPF 鸡胚尿囊腔，从印度受感染的肉鸡中分离到CAstV。

4.4 分子技术检测方法

分子技术检测方法是目前应用范围最广、最普遍的方法，最常用的有RT-PCR、荧光定量PCR以及环介导等温扩增（LAMP）等。Wan 等[80]根据RdRp 序列建立了针对新型GoAstV 的TaqMan RT-qPCR 方法。Yin 等[81]针对新型GoAstV ORF2区域设计新型GoAstV 的检测引物和TaqMan 探针。Jindal 等[82]针对禽轮状病毒NSP4 基因、TAstV-2聚合酶基因和禽呼肠孤病毒S4 保守区域建立了多重RT-PCR 方法。Day 等[83]建立了用于鉴别TAstV-1、TAstV-2、CAstV、ANV 和禽轮状病毒的多重RT-PCR。Smyth 等[84]建立了用于检测ANV和CAstV 的实时TaqMan RT-qPCR 方法。He 等[85]针对新型GoAstV ORF1a 基因开发了一种定量LAMP 方法。Yu 等[86]建立了针对GAstV 的ORF2基因的RT-LAMP 方法。Ji 等[87]针对新型GoAstV ORF1b 基因建立了一种RT-LAMP 方法。

此外，考虑到试验过程中操作误差、核酸提取后抑制物残留等问题，徐蕾蕊等[88]致力于研发星状病毒核酸检测标准物质，以期望保证检测结果的可靠性和核酸扩增检测的质量。

5 防治

星状病毒血清型较多，又缺少适合增殖的胚胎或细胞系，因而弱毒或灭活疫苗产品较少[37]，目前所试验的灭活苗或者亚单位疫苗只针对某个血清型，还没有可以适用于大多数星状病毒的疫苗问世。近年来，越来越多新型星状病毒被发现，而且病毒的环境稳定性强，对消毒剂的耐受力强。星状病毒不止经粪-口途径水平传播，还可以垂直传播，对其净化和控制带了较大困难。除此之外，星状病毒存在较严重的重组现象，使得对病毒的研究更加复杂。

Toth 等[26]将灭活疫苗免疫接种产蛋种鸭，使雏鸭产生一定的抗DAstV-2 能力。另外利用重组衣壳蛋白作为亚单位疫苗也可以产生良好的免疫效果[89-90]。Bassetto 等[91]提出了针对腹泻病毒的聚合酶作为开发单一广谱抗病毒药物的设想，这是因为病毒与聚合酶保持相同的总体结构和功能性基序，是出色的抗病毒靶标。针对疱疹病毒等开发的抗病毒剂证明了该蛋白是鉴定广谱抗病毒剂的最适选择，可以同时阻断大多数甚至所有腹泻诱导性病毒的复制。这为开发新的抗星状病毒药物提供了新思路。

6 小结

近几年，AAstV 给养殖业带来巨大冲击，如以引起痛风为主要特征的GoAstV 在我国多个省份发生，给养殖业造成巨大经济损失。虽然AAstV相关研究已经取得较大成果，如新型AAstV 的发现、分类标准的完善、新的跨宿主传播方式的发现等，对进一步研究提供了非常有价值的参考资料。但是AAstV 亚型多，宿主范围广，具有跨种间传播甚至人兽共患的风险，合适的动物模型较少，致病机制不明，药物研发存在较大难度，检测方法仍需进一步完善，传染给人类的证据不够充分等。这些问题亟待解决，需要进一步加强对AAstV 的研究。