鸭坦布苏病毒快速实时荧光RT-LAMP方法的建立及初步应用

王巧萍，粟柯衡，元正菊，常志顺，张 薇，张以芳，信爱国

（1.云南农业大学动物医学院，云南昆明 650201；2.云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所，云南昆明 650224；3.云南瑞栢泰生物科技有限公司，云南昆明 650041）

鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒（duck Tembusu virus，DTMUV）引起的一种发病急、传播快的传染性疾病[1]。DTMUV 最初于1955 年在马来西亚吉隆坡的库蚊体内被分离到，主要引起蛋鸭产蛋率以及种蛋受精率和孵化率下降，生长速度降低，部分病鸭出现神经症状[2]，甚至死亡。DTMUV 的宿主范围广泛，所有品种的鸭、鹅、鸡、麻雀、鸽子[3]等均可被感染。DTMUV 接种于小鼠颅内后，小鼠的发病症状与禽类相似[4]。DTMUV 属于黄病毒科黄病毒属Ntaya 病毒群，而黄病毒科的许多成员如登革热病毒、森林脑炎病毒、乙脑病毒等都对人类健康构成威胁[5]。鸭坦布苏病毒病也具有公共卫生学意义，从养鸭场员工的血清中可检出DTMUV 抗体，说明该病毒能够在人与鸭之间传播[6]。临床发现本病造成的死亡率虽然较低[7]，但感染DTMUV 的鸭会因继发其他机会致病菌感染而死亡。迄今为止，DTMUV 给我国养鸭业造成了至少数十亿元的损失[8]。

DTMUV 引起的临床症状不特异，与高致病性禽流感病毒等病原微生物引起的症状类似。用于诊断DTMUV的方法有病毒分离鉴定、血清学诊断、核酸检测技术等。病毒分离鉴定试验周期长、操作复杂，血清学检测中的ELISA 需要酶标仪等仪器设备，而核酸检测中的qRT-PCR 和普通RT-PCR对设备和操作人员的技术水平要求高，花费时间长，不适合样品的快速和大规模检测。因此，建立一种能快速检测DTMUV 的方法显得尤为重要。逆转录环介导等温扩增（reverse transcription loopmediated isothermal amplification，RT-LAMP）是一种新型核酸扩增技术，根据靶基因的6 个区域设计特异性引物，在体系中加入有强链置换活性功能的BstDNA 聚合酶，可以实现等温条件下核酸的指数型扩增，现已广泛应用于多种病原微生物的检测[9]。目前，RT-LAMP 的检测结果多通过琼脂糖凝胶电泳、浊度法、SYBR Green I 染料法等进行肉眼观察，判断不够准确，且容易发生污染。本试验根据DTMUVNS5基因设计引物，通过优化反应条件，建立了一种检测DTMUV 的荧光RT-LAMP检测方法，为DTMUV 的实验室临床检测和流行病学调查提供了有效手段。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料

DTMUV、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、I 型鸭肝炎病毒（duck hepatitis virus I，DHV-I）、III 型鸭肝炎病毒（duck hepatitis virus III，DHV-III）、传染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）、7 日龄建水黄褐鸭，均由云南省畜牧兽医科学院养禽与禽病研究所提供；禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）H5、H7、H9 亚型抗原，购自华南农大生物药品有限公司；

RNA 提取试剂盒TaKaRa MiniBEST Universal RNA/DNA Extraction Kit，购自宝生物工程（大连）有限公司；FastKing RT Kit（With gDNase）FastKing cDNA 第一链合成试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；PCR 试剂（2×SanTaqPCR Mix）购自上海生工生物技术有限公司；等温扩增试剂Isothermal Master Mix（IMM），购于英国OptiGenie Limited 公司；Genie II 等温扩增荧光检测系统，由云南瑞栢泰生物科技有限公司提供。

1.2 引物设计与合成

采用VectorNTI 8.0 序列分析软件，对已发表的DTMUVNS5基因（登录号为KJ958533）保守序列进行对比分析，利用Lamp designer 软件设计荧光RT-LAMP 引物，包含1 对外引物（正向外引物DTMUV-F3 和反向外引物DTMUV-B3）、1 对内引物（正向内引物DTMUV-FIP 和反向内引物DTMUV-BIP）和1 对环引物（正向环引物DTMUV-LF 和反向环引物DTMUV-LB）。所有引物序列详见表1，引物由硕擎生物科技有限公司合成。

表1 DTMUV 引物信息

1.3 病毒核酸提取及反转录

按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA/DNA Extraction Kit 说明书提取DTMUV 及其他病毒核酸，用核酸定量仪测定浓度，按FastKing RT Kit（With gDNase）FastKing cDNA 第一链合成试剂盒说明书将RNA 反转录为cDNA。将cDNA 于-20 ℃保存，RNA 于-80 ℃保存备用。

1.4 普通RT-PCR 和qRT-PCR 扩增

普通RT-PCR 反应体系为25.0 μL，包括2×SanTaqPCR Mix 12.5 μL，RNase-free ddH2O 9.5 μL，上下游引物（浓度均为10 pmol/L）各1.0 μL，cDNA 1.0 μL。反应程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 7 min，最后4 ℃冷却。PCR 结束后取5.0 μL产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳，用凝胶成像系统观察结果。

qRT-PCR 的反应体系及反应条件等相关信息参考文献[10]。

1.5 荧光RT-LAMP 方法的建立

试验采用25.0 μL 反应体系，包括Isothermal Master Mix（IMM）等温扩增试剂15.0 μL，DTMUV-F3（5 μmol/L）1.0 μL，DTMUV-B3（5 μmol/L）1.0 μL，DTMUV-BIP（40 μmol/L）1.0 μL，DTMUVFIP（40 μmol/L）1.0 μL，DTMUV-LB（20 μmol/L）1.0 μL，DTMUV-LF（20 μmol/L）1.0 μL，cDNA 2.0 μL，RNase-free ddH2O 2.0 μL。将反应管置于Genie Ⅱ等温扩增荧光检测系统中，反应程序为，65 ℃ 30 min，退火从98～80 ℃，0.05 ℃/s。在体系的基础上，根据引物的Tm 值将温度按照54、56、58、60、62、64、66、68 ℃依次递增，反应时间按照20、25、30 min 多次重复，反应结束后观察扩增曲线，出现“S”型扩增曲线为阳性，否则为阴性。

1.6 荧光RT-LAMP 特异性试验

用确定的最佳试验条件分别对DTMUV 阳性样品及其他几种病毒cDNA 进行荧光RT-LAMP 检测，观察扩增曲线以明确该方法是否与其他禽类病毒存在交叉反应，从而评价该方法的特异性。

1.7 荧光RT-LAMP 敏感性试验

将DTMUV cDNA 用RNase-free ddH2O 连 续10 倍倍比稀释作为检测样品，按最佳试验条件进行荧光RT-LAMP 扩增，测定模板最低检出量，以判定该方法的敏感性。同时将其与普通RT-PCR 和qRT-PCR 敏感性进行比较。

1.8 荧光RT-LAMP 重复性试验

将同一批次的DTMUV 细胞毒cDNA 分装成3 份，-20 ℃保存。在同一天的3、6、9 h 分别进行荧光RT-LAMP 重复检测，每个样品做3 个重复，此为批内重复性试验；在试验的第1、3、5 天分别提取RNA 并反转录为cDNA 后进行荧光RTLAMP 检测，每个样品做3 个平行重复，此为批间重复性试验。

1.9 荧光RT-LAMP 的初步应用

经测定，DTMUV 滴度为103.7TCID50/0.1 mL。将40 只7 日龄建水黄褐鸭平均分成4 组。其中，3组为试验组，分别按照0.1 mL/只腿肌注射接种原液（103.7TCID50）以及10-1稀释（102.7TCID50）和10-2稀释（101.7TCID50）的病毒液，1 组为对照组，注入等体积灭菌PBS。攻毒5 d 后处死各组鸭，分别采集每只鸭肝脏作为检测样品，提取样品RNA并反转录为cDNA 进行荧光RT-LAMP 检测，同时用普通RT-PCR 和qRT-PCR 进行检测并比较阳性检出率。

2 结果

2.1 荧光RT-LAMP 温度筛选

经过条件优化，最适反应温度为64～66 ℃，65 ℃为最佳（图1）。

2.2 荧光RT-LAMP 特异性试验

将DTMUV 与NDV、DHV-I、DHV-III、IBDV 以 及AIV 亚型抗原（H5、H7、H9）的cDNA 在最佳反应条件下进行扩增。结果显示，仅DTMUV 有“S”型扩增曲线（图2），产生尖峰状特异性熔解曲线（图3），而其他几种病毒cDNA 均无扩增曲线。

2.3 荧光RT-LAMP 敏感性试验及反应时间筛选

将DTMUV 的cDNA（原始质量浓度为9 ng/μL）用RNase-free ddH2O 连续10 倍梯度稀释作为模板进行荧光RT-LAMP 反应。结果发现，荧光RT-LAMP的最低检测限为10-5稀释度，即9×10-2pg/μL，换算成拷贝数为4×102copies/μL；观察敏感性试验扩增曲线可知，25 min 之后为扩增曲线的平台期，20 min 时部分扩增曲线未达平台期，取25 min 为最佳反应时间（图4）；敏感性试验的熔解曲线均为90.5～90.7 ℃，最大误差为0.2 ℃，误差率为0.2%，属于试验误差（图5）；qRT-PCR 的检测限为10-5稀释度，即9×10-2pg/μL，换算成拷贝数为4×102copies/μL（图6）；普通RT-PCR 的检测限为10-3稀释度，即9 pg/μL，换算为拷贝数为4×104copies/μL（图7）。结果表明，荧光RT-LAMP 方法的敏感性与qRT-PCR 方法一致，是普通RT-PCR 的100 倍。

2.4 荧光RT-LAMP 重复性试验结果

DTMUV cDNA 的批内重复性试验结果显示，在3 h（图8）、6 h（图9）、9 h（图10）的结果均为阳性；批间重复性试验的结果显示，在第1 天（图11）、3 天（图12）、5 天（图13）的结果均为阳性，表明本方法重复性良好。

2.5 人工感染样品检测

将人工感染剂量为103.7、102.7、101.7TCID50的鸭组织采用荧光RT-LAMP、qRT-PCR 和普通RT-PCR 分别进行检测。结果（表2）显示，荧光RT-LAMP 和qRT-PCR 的检测结果接近，普通RT-PCR 检出率最低。

3 讨论

本试验针对DTMUVNS5基因建立的荧光RT-LAMP 方法是将荧光染料插入扩增产物的双链DNA 中，产生并发散荧光信号，荧光信号的累积与LAMP 产物的形成同步，结果可通过读取扩增曲线，同时观察熔解曲线判断是否为特异性扩增，实现对样品的快速、全封闭式检测，避免气溶胶污染和假阳性。相对于目前常规采用琼脂糖凝胶电泳、浊度法、SYBR Green I 染料法、钙黄绿素显色法或者羟基萘酚蓝（HNB）等使用肉眼观察的RT-LAMP 方法，荧光RT-LAMP 方法具有明显的优势。

试验根据熔解曲线和Tm 值对反应时间和温度进行优化，避免非特异性扩增和引物二聚体对试验结果造成的干扰，结果判定具有客观性和可靠性。目前国内学者建立的DTMUV RT-LAMP 检测方法[11-14]扩增时间均超过45 min，普通RT-PCR 需2 h，qRT-PCR 需1 h，而本试验建立的荧光RTLAMP方法仅需25 min，即可实现核酸的快速扩增，适合大规模样品检测。该方法具有良好的特异性，NDV、DHV-I、DHV-III、IBDV、AIV 亚 型H5、H7、H9 抗原的核酸均不能检出，而检测DTMUV的熔解曲线呈尖峰状，说明产物单一，特异性良好。批内和批间重复性结果证明其重复性良好。敏感性方面，对于同一份cDNA 样品，荧光RT-LAMP和qRT-PCR 的最低检测限均为9×10-2pg/μL，即4×102copies/μL，普通RT-PCR 的检测限为9 pg/μL，即4×104copies/μL，荧光RT-LAMP 方法的敏感性与qRT-PCR 方法一致，是普通RT-PCR 的100倍，说明荧光RT-LAMP 的敏感性良好，且其敏感性高于其他学者对DTMUV 建立的RT-LAMP方法[15-16]。初步应用该方法，检测人工接种试验鸭的肝脏，对感染剂量为103.7TCID50的样品，荧光RT-LAMP、qRT-PCR 和普通RT-PCR 阳性检出率均为100%（10/10）；对感染剂量为102.7TCID50的样品，荧光RT-LAMP 和qRT-PCR 方法检出率均为100%（10/10），普通RT-PCR 检出率为80%（8/10）；对于感染剂量为101.7TCID50的样品，普通RT-PCR 检出率为50%（5/10），qRT-PCR 阳性检出率为100%（10/10），荧光RT-LAMP 阳性检出率为90%（9/10），说明荧光RT-LAMP 可用于组织感染样品的检测，且其检出率高于普通RT-PCR，与qRT-PCR 接近。

试验根据DTMUVNS5基因建立的荧光RT-LAMP 检测方法具有较强的特异性、重复性和敏感性，65 ℃ 25 min 即可完成快速检测，为DTMUV的临床检测和流行病学调查提供了技术支持。