流浪犬狂犬病口服疫苗免疫效果评估

白艺兰，杨显超，刘 健，夏炉明，陈伟锋，龚国华，朱晓英，陶田谷晟，常晓静，桂亚萍，李增强，王 建，赵洪进

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

狂犬病（rabies）俗称“疯狗病”，是一种主要在犬科动物中传播和流行的人兽共患传染病。患病动物或者人一旦发病，死亡率几乎为100%[1]。在狂犬病预防和控制中，疫苗免疫是主要措施[2]。目前，我国广泛使用的狂犬病灭活疫苗均为注射剂，对流浪犬及野生动物适用性不强，而狂犬病口服疫苗已在部分发达国家野生动物狂犬病防控中起到重要作用。因此对流浪犬采用狂犬病口服疫苗免疫，提高免疫合格率，是控制狂犬病在流浪犬中流行的可行措施之一[3]。

以犬2 型腺病毒（canine adenovirus type 2，CAV-2）为载体表达狂犬病病毒糖蛋白（RABV-G）的重组活疫苗，因其自身优点得到越来越多的研究应用[4]。CAV-2 能够高效转导外源基因，刺激呼吸道及消化道，诱发黏膜免疫，增强机体免疫原性[5]。此外，CAV-2 不能在人体内复制，其生产及使用安全系数高[6]。CAV2-ΔE3-CGS 是以CAV-2 缺失E3基因为载体表达狂犬病病毒糖蛋白的重组病毒疫苗，经口服可使犬产生狂犬病病毒糖蛋白抗体，已于2007 年获得农业部颁发的农业转基因生物安全证书（生产应用）。为了解CAV2-ΔE3-CGS 口服疫苗在流浪犬体内产生的抗体水平，探索抗体的产生规律，选取上海市收容的流浪犬进行CAV2-ΔE3-CGS 口服疫苗免疫试验，测定狂犬病病毒ELISA 抗体，以期为流浪犬狂犬病免疫提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物来源 上海市公安局犬类留验所收容的流浪犬。

1.1.2 疫苗和主要试剂 狂犬病口服疫苗CAV2-ΔE3-CGS 及诱饵原料（肉骨粉、面粉、犬粮、鱼粉），由军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所扈荣良老师惠赠；传统狂犬病疫苗，购自默沙东动物保健品（上海）有限公司；食品级肠衣，购自当地农贸市场；MDCK 细胞，由上海市动物疫病预防控制中心兽医实验室保存；犬腺病毒（CAV）IgG 抗体ELISA 检测试剂盒（批号D031521），购自荷兰EVL 公司；狂犬病病毒抗体ELISA 检测试剂盒（批号19ZEAW010），购自美国SYNBIOTICS 公司；犬瘟热病毒RT-PCR 检测试剂盒（EC20200601）、犬细小病毒PCR 检测试剂盒（批号EC20200602-01），均购自上海尔创生物技术有限公司。

1.2 口服疫苗病毒株病毒滴度TCID50 测定

取生长状态良好的MDCK 细胞，以胰酶消化后用DMEM 培养基重新悬浮，接种至96 孔板，每孔100 μL（2×106个细胞/mL）；待细胞长成单层后，弃去上清，每孔加入100 μL 10 倍倍比稀释的CAV2-ΔE3-CGS 病毒液，共11 个稀释度，每个稀释度重复8 个孔，最后一列为空白对照，混匀后置于37 ℃感作1 h；弃去培养液，加入2% DMEM培养基在37 ℃、5% CO2培养箱中培养72 h；通过显微镜观察细胞病变情况，按Reed-Muench 法计算病毒TCID50，将病毒液按照每头份1×108个TCID50的规格进行分装，冻干，置于-20 ℃保存备用。

1.3 口服疫苗诱饵制备

准备1 kg 诱饵原料（肉骨粉40%、面粉25%、犬粮30%和鱼粉5%），加入200 g 纯净水后充分混匀成面团状，用骨型模具压制成骨头形状，60 ℃烘干12 h 后成型。诱饵规格为骨型，长10.0 cm，中间宽1.5 cm；中空，空腔长、宽、高分别为5.0、1.0、0.3 cm，中间放入肠衣包裹的狂犬病口服疫苗CAV2-ΔE3-CGS，并用食用蜡密封。其中狂犬病口服疫苗CAV2-ΔE3-CGS 制作流程：将肠衣制成长、宽、高分别为5.0、1.0、0.3 cm 规格的密封袋，每个里面装有1×108个TCID50的口服疫苗冻干粉。

1.4 试验犬只确定及免疫分组

1.4.1 狂犬病病毒抗体ELISA 检测 从犬类留验所收容的流浪犬中随机挑选32 只（编号为1～32），采集血清，应用狂犬病病毒抗体ELISA试剂盒开展检测，剔除狂犬病抗体阳性犬只。

1.4.2 CAV IgG 抗体ELISA 检测 对剔除狂犬病抗体阳性犬后的剩余犬只，应用CAV IgG 抗体ELISA 试剂盒开展检测，剔除CAV 抗体阳性犬只。

1.4.3 犬瘟热病毒、犬细小病毒病原学检测 采集流浪犬肛拭子，应用犬瘟热病毒RT-PCR 检测试剂盒、犬细小病毒PCR 检测试剂盒，进行犬瘟热、犬细小病毒检测，剔除犬瘟热、犬细小病毒病原学检测阳性犬只。

1.4.4 流浪犬分组 对12 只检测合格的流浪犬进行分组标记，其中CAV2-ΔE3-CGS口服免疫组5只、传统疫苗注射组5 只、阴性对照组2 只。统计试验犬只犬种、月龄、性别等基本信息。

1.5 免疫程序

1.5.1 口服疫苗CAV2-ΔE3-CGS 组 CAV2-ΔE3-CGS疫苗对犬只进行两次口服免疫，首次免疫（首免）2 周后进行加强免疫（二免）。首次免疫后每周采集血清1 次，二免后第3 周停止采血。

1.5.2 传统疫苗注射组 按照免疫注射要求，将传统狂犬病注射疫苗对犬只进行1 次注射免疫，免疫后每周采集血清1 次，采集至注射疫苗二免后第3 周。

1.5.3 阴性对照组 阴性对照组犬只口服不含CAV2-ΔE3-CGS 疫苗的诱饵，同样进行两次口服。首次口服后每周采集血清1 次，二次口服后第3 周停止采血。

1.6 狂犬病抗体检测

按照免疫程序采集试验犬只血清（包括免疫前血清），使用狂犬病病毒抗体ELISA 试剂盒进行抗体检测，评估疫苗免疫效果。

2 结果

2.1 狂犬病抗体水平ELISA 检测

采集试验犬只血清，使用ELISA 试剂盒测定狂犬病病毒血清抗体水平，检测结果见表1。口服疫苗组犬只抗体产生速度较慢，8、10 和13 号犬只在二免后第3 周抗体水平分别达0.87、1.23、1.68 IU/mL，超过了国标GB/T 34739—2017 中要求的0.50 IU/mL，即产生了完全保护力；7、15 号犬只在两次免疫后抗体水平最高仅分别为0.20 和0.07 IU/mL，未产生完全保护力。传统疫苗注射组中，26、27 和28 号犬只在免疫后1周即产生了抗体，其中26、27 号犬只抗体水平均超过0.50 IU/mL，28 号犬只在免疫后第2 周抗体水平超过0.50 IU/mL；21 号犬只抗体产生较慢，在免疫后第5 周抗体水平才达0.52 IU/mL；23 号犬只免疫后抗体水平最高仅为0.22 IU/mL，没有产生完全保护力。阴性对照组犬只抗体水平均为0，对照成立。

表1 流浪犬狂犬病病毒抗体水平ELISA 检测结果

2.2 狂犬病病毒抗体水平消长趋势

口服疫苗组60%犬只狂犬病病毒抗体达到保护水平（抗体合格率60%），其平均抗体水平在二免后呈直线上升趋势（图1）。首免后1 周，抗体水平基本为0，但是首免2 周后平均抗体水平达到0.23 IU/mL；二免后抗体水平首先呈下降趋势，在二免后第3 周抗体水平快速上升，平均抗体水平达0.81 IU/mL。传统疫苗注射组犬只狂犬病抗体水平合格率为80%，平均抗体水平在免疫后第1 周即能达到0.30 IU/mL，免疫后2 周可达0.68 IU/mL，然后保持在较高水平。

3 讨论

人和犬的狂犬病在大多数发达国家和部分发展中国家都已消除，其措施主要是对家养犬进行大面积疫苗免疫并采取严格预防措施，对野生动物进行诱饵口服免疫，切断野生动物狂犬病传播至犬而再度传播至人的途径，最终达到持久性消除狂犬病效果[7]。在口服疫苗对野生动物免疫成功的基础上，世界卫生组织（WHO）提出并建议采用诱饵口服免疫流浪犬，以提高犬的免疫覆盖率，从而达到控制和消除狂犬病的目的[8-9]。2009—2019 年，上海市人间狂犬病病例传染源主要来自流浪犬[10]，虽然没有直接证据表明流浪猫是狂犬病的直接传染源，但流浪猫依然是狂犬病的潜在宿主。因此，口服疫苗免疫是城市流浪动物狂犬病免疫的主要手段之一，也是传统注射免疫的重要补充。

上海市公安局犬类留验场内收留流浪犬只多为田园犬。本试验选取健康流浪犬作为试验动物，饲喂口服疫苗前，应用狂犬病病毒ELISA 试剂盒进行抗体检测，剔除了抗体水平≥0.50 IU/mL 的抗体阳性犬只，免疫前血清中存在的低量狂犬病病毒抗体不会对试验结果产生影响。受流浪犬留验场环境及工作人员数量限制，最终选取12 只流浪犬作为试验动物开展初步评估，试验结果对后续口服疫苗优化及免疫程序制定将起到参考作用。

口服疫苗组中，不同品种、性别、月龄的犬只平均抗体水平总体呈波浪状上升趋势。首免后抗体水平虽快速上升，但是幅度不大，只有13 号犬只抗体水平达到0.61 IU/mL；二免后抗体水平开始下降，二免第2 周后迅速升高，第3 周后平均抗体水平达到0.81 IU/mL，说明CAV2-ΔE3-CGS 疫苗口服一次不能完成免疫，应进行两次才能达到较好保护水平。口服疫苗CAV2-ΔE3-CGS 免疫抗体合格率为60%，说明CAV2-ΔE3-CGS 疫苗口服免疫可以使过半数流浪犬产生狂犬病病毒抗体，抗体水平高于国标GB/T 34739—2017 所要求的0.50 IU/mL，可产生完全保护作用，符合狂犬病防控中对于狂犬病疫苗的要求[11]。陈奇等[12]以表达狂犬病病毒SRV9 株糖蛋白的重组杆状病毒接种小鼠，发现其可诱导产生抗狂犬病病毒中和抗体，达到保护水平的小鼠比例可达100%。韩乃君等[6]研究显示，口服和注射一次表达狂犬病病毒糖蛋白的CAV-2 活载体重组疫苗，可使中和抗体达到保护水平。此外，留验场收容犬的免疫状态、生活环境和饲养条件均可能影响免疫效果。本试验中，7 号和15 号犬只抗体水平未能达到保护效价，推测可能与诱饵适口性[13]、流浪犬免疫状态、个体差异、环境条件、营养、温度等因素有关。加之在进行流浪犬口服免疫时，气温较低，饲养环境较差，犬只有不同程度感染和发病，可能也会间接导致口服免疫失败。传统疫苗注射组23 号犬只抗体未能达到保护水平以及21 号犬只抗体产生缓慢，也间接反映出部分流浪犬免疫状态不佳，免疫应答迟缓。

CAV2-ΔE3-CGS 疫苗为CAV-2 载体缺失重组活疫苗，免疫流浪犬后可产生狂犬病病毒G 蛋白抗体和CAV-2 抗体，流浪犬机体中带有CAV 抗体会严重影响免疫效果。因此，在有专人集中管理、有条件进行群体免疫的流浪犬收容场所，建议对流浪犬CAV 本底抗体进行检测，评估犬群是否可免疫CAV2-ΔE3-CGS 口服疫苗，以提高免疫效果[14]。同时要加强流浪犬群体疫病防控和饲养管理，防止免疫过程中产生应激或继发其他疫病。CAV2-ΔE3-CGS 口服疫苗虽然能使流浪犬产生保护性抗体，但是免疫犬抗体本底情况、饲养条件、健康状况、诱饵剂型、免疫程序等都会影响免疫效果，应当进一步研发合理的诱饵剂型，探索肠溶型诱饵制剂，提高肠黏膜免疫[15]，摸索最佳免疫程序，制定合理免疫方案，从而使口服疫苗达到最佳免疫效果。