一株罗非鱼无乳链球菌的分离鉴定及药敏试验

李永福，李 敏，叶毅飞，丁文桂，黄炳炽，张险朋

（1.东莞市动物疫病预防控制中心，广东东莞 523086；2.佛山科学技术学院，广东佛山 528231）

罗非鱼（Oreochromsmossambcus）又称非洲鲫鱼，刺少且肉质鲜嫩，食性广，生长繁殖快，抗病能力强，已经成为100 多个国家和地区的养殖品种[1]。关于罗非鱼链球菌感染的报道最早见于20世纪80 年代[2]，90 年代感染呈上升趋势。该菌已成为罗非鱼的重要致病菌之一。目前，已经有多个国家暴发罗非鱼链球菌病（streptococcosis），如美国、巴西、哥伦比亚、泰国、印度尼西亚、洪都拉斯、哥斯达黎加、厄瓜多尔和中国等[3-9]。罗非鱼作为我国主要的淡水养殖品种之一，年产量大[10]，但罗非鱼链球菌病的大面积暴发，给罗非鱼的健康养殖带来了严重威胁。有报道[10]称，罗非鱼链球菌病主要有两种病原，即无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）和海豚链球菌（S.iniae）。张新艳等[11]、谭晶晶等[12]、祝璟琳等[13]相继从罗非鱼中分离出无乳链球菌，卢迈新等[14]通过传统的生理生化分析、分子生物学鉴定和人工感染回归试验等，研究确定无乳链球菌是引发我国南方罗非鱼主产区的主要病原菌。研究[15-16]发现，无乳链球菌可感染多种经济鱼类，传染性强，病死率高，对罗非鱼危害尤为严重，鱼类感染后表现眼球突出、鳃盖内侧出血、肛门红肿等典型外观症状。

2021 年7 月21 日，在东莞市某养殖场的濒死罗非鱼上分离到一种病原菌，通过生理生化鉴定、VITEK-2 Compact 全自动细菌鉴定仪和16S rRNA分子鉴定，确定此病原菌为无乳链球菌，将其命名为DG210721，并利用药敏分析试剂板对该株细菌进行了抗菌药物敏感性分析。本研究对罗非鱼养殖业细菌病的病原鉴定和防控具有一定的临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 2021 年7 月，东莞市某养殖场的罗非鱼出现打转游动、眼球突出充血等症状，伴有死亡。采集病鱼的脑、肝脏、脾脏、肾脏等组织样品进行细菌培养。

1.1.2 主要试剂 THB 培养基，购自广东环凯微生物科技有限公司；B 族链球菌显色培养基，购自法国科玛嘉公司；动物用药敏分析试剂，购自南京菲恩医疗科技有限公司；链球菌细菌鉴定卡，购自Biomerieux 公司；细菌提取试剂，购自上海之江生物科技有限公司；2×TaqMix 预混液，购自天根生化科技（北京）有限公司；DNA Marker，购自TAKARA 公司；50×TAE 和GelRed 核酸染料，购自Biosharp 公司；琼脂糖，购自Biofroxx 公司；引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3 仪器设备 生物安全柜（Class ⅡBSC）、超净工作台（ABC-4A1），购自新加坡艺思高科技有限公司；全自动细菌鉴定仪（VITEK2Compact），购自法国梅里埃公司；PCR 仪（Mastercycler nexus gradient），购自eppendorf公司；水平电泳系统（Wide Mini Sub-cell&Power Pac Basi），购自Bio-rad 公司；凝胶成像仪（GelDoc-it TS2），购自美国UVP 公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养 用75%的酒精棉球擦拭鱼的体表，无菌水冲洗后用接种环蘸取脑、肝脏、脾脏、肾脏等组织样品，分别划线接种于THB 平板，35 ℃培养24 h，观察菌落的生长特性，挑起菌落进行革兰氏染色，镜检；选取形状、色泽和大小一致的优势单菌落，重复划线分离培养获得纯种病原菌（菌株编号为DG210721）。鱼的解剖、细菌接种均在生物安全柜内完成。

1.2.2 B 群链球菌显色培养基培养鉴定 对DG210721 菌株进行革兰氏染色，显微镜下观察菌株的形态；划线接种于显色培养基，35 ℃恒温培养24 h 后观察菌落颜色。参照B 群链球菌显色培养基结果判断病原菌种类：紫色菌落为无乳链球菌（S.agalactiae），深蓝色的为肠球菌（Enterococcus species），亮粉色、少量生长或抑制的为乳酸杆菌（Lactobacilli）、明串珠菌（Leuconostoc）或乳酸乳球菌（Lactococci），蓝色、无色或抑制的为其他菌群。

1.2.3 生理生化试验 用无菌棉拭子取适量的DG210721 菌培养菌落至0.45% NaCl 溶液，配制成0.50～0.63 麦氏浊度的细菌混悬液，用VITEK-2 Compact 全自动细菌鉴定仪进行鉴定。

1.2.4 PCR 检测及序列分析 参照链球菌DNA提取试剂说明书，对DG210721 菌株进行核酸提取。参考行业标准SC/T 7235—2020 中16S rRNA 基因DNA 序列设计通用引物27 F 和1 492 R（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。用无菌去离子水稀释成10 µmol/L后于-20 ℃保存备用。按PCR Master Mix 说明书（版本号KT171207）标示配制反应体系。PCR 反应体系（25.0 µL）：PCR Master Mix 12.5 µL，上、下游引物（10 µmol/L）各1.0 µL，用ddH2O 补足体系。将反应液分装到0.2 mL PCR 管中，然后分别加入等体积的待检样品、空白对照和阴性对照。空白对照为空培养皿，阴性对照为DEPC 水。混匀后瞬时离心，进行PCR 扩增反应。引物序列和反应程序见表1。用1×TAE 电泳缓冲液配制1% 的琼脂糖（含10 000×GelRed 核酸染料）凝胶；将上述5.0 µL PCR 产物加入点样孔，使用DNA Marker 作对照；100 V 电泳约40 min，当溴酚蓝距底部2/3 时停止，于紫外光下观察电泳条带的数量和位置。将PCR扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果与GenBank 数据库中的已知序列进行比对分析。登录NCBI 下载代表性链球菌属16S rRNA 核酸序列，利用Mega7.0 软件，构建分离株DG210721 的系统发育进化树，设定运算法则为Neighbor-Joining，Bootstrap 值为1 000，模型为Kimura-2。

表1 罗非鱼无乳链球菌16s rRNA 检测所需的引物序列、反应程序

1.2.5 最小抑菌浓度（MIC）测定 微量肉汤稀释法：挑取菌种DG210721 培养的单个菌落于5 mL生理盐水中，制成0.5 麦氏单位浓度的菌悬液A；取200 µL 菌悬液A，用无菌生理盐水稀释100 倍，制成0.005 麦氏单位浓度的菌悬液B；取200 µL菌悬液B 加入到药敏分析试剂板，28 ℃恒温培养24 h 后读取结果。结果判断：药敏分析试剂板孔底变浑浊为阳性“+”，澄明为阴性“-”。在微孔内完成MIC 测定。本次试验选用的药敏分析试剂板共有恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、盐酸多西环素、氟甲喹、磺胺间甲氧嘧啶钠和磺胺甲噁唑等8 种水产养殖用抗菌药物，每种抗菌药物设12 个梯度浓度，每个梯度减半，其中磺胺甲噁唑添加了磺胺增效剂甲氧卞啶。

2 结果

2.1 细菌培养

从发病罗非鱼的脑、肝脏、脾脏、肾脏组织样品中分离纯化获得1 株优势菌（菌株编号为DG210721）。培养的菌落在THB 平板上生长良好，呈现乳白色、圆形、边缘光滑且隆起（图1-A）；革兰氏染色阳性，单个、成双或链状排列，长短不一（图1-B）。该菌落在B 族链球菌显色培养基35 ℃恒温培养24 h 后，菌落呈现紫色（图1-C），根据B 群链球菌显色培养基结果对照表判断分离的病原菌为无乳链球菌。

2.2 细菌鉴定

将菌株DG210721 进行革兰氏染色、镜检确定为阳性后，使用VITEK-2 Compact 革兰氏阳性鉴定卡进行鉴定，鉴定结果为无乳链球菌（95%的置信度），结果详见图2。

2.3 16S rRNA PCR 检测和序列分析

PCR 扩增菌株DG210721 的16S rRNA 基因，获得约1 500 bp 的清晰条带（图3）。经测序、比对分析PCR 扩增产物发现，菌株DG210721 与NCBI 数据库中S.agalactiae（登录号JQ039371、OK047709、MN686586）的16S rRNA 基因序列同源性分别为100%、100%和99.9%。产物的测序结果详见表2。从构建的系统发育树（图4）可知，无乳链球菌、海豚链球菌、停乳链球菌（S.dysgalactiae）各形成独立分支，分离株DG210721 与无乳链球菌处于同一分支，即与无乳链球菌聚为一类，表明该分离株为无乳链球菌。

表2 菌株DG210721 核酸产物测序结果

2.4 MIC 测定

菌株DG210721 对8 种水产养殖用抗菌药物的敏感性存在差异，其中盐酸多西环素对其抑制效果最好，其次是恩诺沙星（MIC 是0.25 µg/mL）、甲砜霉素（MIC 是1 µg/mL）、氟苯尼考（MIC 是2 µg/mL）、氟甲喹（MIC 是4 µg/mL）、磺胺甲噁唑+甲氧苄啶（MIC 是4.8/0.25 µg/mL）、磺胺间甲氧嘧啶钠（MIC 是16 µg/mL）和硫酸新霉素（MIC 是16 µg/mL），详见表3。相比磺胺间甲氧嘧啶钠，磺胺甲噁唑与磺胺增效剂甲氧苄啶的合用提高了药物敏感性。

表3 药敏分析结果

3 讨论

无乳链球菌为革兰氏阳性球菌，又称B 群链球菌（GBS），是一种β-溶血性链球菌，可以感染包括人在内的多种宿主，同时也是牛乳腺炎和鱼链球菌病的主要致病菌[17-19]，大约有1/3 人的肠道、泌尿器官中可分离出无乳链球菌。无乳链球菌会引发新生儿、老年人和免疫功能低下者的严重感染[20-22]。在过去的20 年里，成人感染无乳链球菌的比例有所增加，通常表现为隐匿性菌血症、皮肤及软组织感染和尿路感染，而脑膜炎比较少见[23]。研究[23-24]发现：人源无乳链球菌可以感染罗非鱼并导致其发病、死亡；虽然无乳链球菌尚未被定义为一种食源性病原体，但在2015年，新加坡曾发生一起因食用鳙鱼等淡水鱼生引发的无乳链球菌感染疫情，在停止销售、食用鱼生后，疫情得到迅速缓解。因此，对该菌的研究具有重大的公共卫生意义。2013 年可小丽等[25]在对广东、海南等地25 株罗非鱼链球菌病原进行鉴定时发现：源自广州江高地区的无乳链球菌分离株GRS0574（GenBank 登录号：JQ039371），与本次试验分离的DG210721 株同处在一个进化小分支中，且16S rRNA 基因同源性达100%，提示DG210721和JQ039371可能具有相同的细菌特征，本次试验分离的无乳链球菌与广州江高主养区大规模罗非鱼链球菌病病原菌可能同源。本次试验还发现：DG210721 与2021 年越南罗非鱼分离株015-RIA1（GenBank 登录号：OK047709）和2019年四川奶牛分离株SCQL[26]（GenBank 登录号：MN686586）距离较近。

近年来，罗非鱼病害发生时，个别养殖户乱用、滥用抗菌药物或长期使用单一药物，这不仅会导致病原菌产生耐药性，难以有效控制疫病，还会影响食品安全。此外，抗菌药物可随鱼排泄物扩散到环境中，给水产养殖业的可持续性发展构成威胁。研究[27]发现，细菌能通过携带可转移遗传因子使耐药性广泛传播。因此，使用抗菌药物不是可持续的鱼类疫病防控、治疗方式。有报道[13]称，无乳链球菌对强力霉素、利福平和阿莫西林等药物敏感。本次试验根据《水产养殖用药明白纸2020 年2 号》，选用了硫酸新霉素等8 种药物对菌株DG210721 进行药敏试验发现：盐酸多西环素在药物质量浓度为0.06 µg/mL 时，抑菌效果依旧明显；而磺胺间甲氧嘧啶钠和硫酸新霉素的抑菌效果最差（MIC 是16 µg/mL）。因此，在选择药物之前，分离致病菌并且进行药物敏感性检测，会提高疫病防控效果。本次试验还发现：磺胺甲噁唑与甲氧苄啶合用的MIC 是4.8/0.25 µg/mL，表明合用可提高药物敏感性。建议在实际使用磺胺药时，适量添加磺胺增效剂，这样可减少药物的使用量。在罗非鱼养殖生产中，选用国家允许使用的药物，严格遵循休药期，配合使用改善水环境的微生态制剂，口服保健预防类的中药，对“减抗、无抗”养殖、改善池塘水质和预防疾病发生具有更加积极的作用。

因链球菌会感染鱼的脑部，相比其他环境中的许多条件致病菌更具侵袭性。常规抗菌药物难以突破脑屏障，且感染后期病鱼几乎不吃料，所以在罗非鱼养殖过程中疾病预防尤其重要。罗非鱼链球菌病多发于水质差、养殖密度大的水域，长期使用低质饲料也是诱因之一[28-33]。而有些罗非鱼养殖户通过池塘中少量混养草鱼（Ctenopharyngodon idella）、鳙鱼（Aristichthys nobilis）和凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei），水面种植药用植物、空心菜等，使水体中氨氮、亚硝酸盐降低，继而使鱼体发病率和死亡率也得到了控制[34]。因此，改善池塘养殖环境尤为重要。在养殖过程中，首先要加强养殖环境管理，对池塘彻底消毒，清除池底过多淤泥，经常加注新水，增加水体溶解氧，投喂新鲜饵料，做到“定时、定位、定值、定量”四定原则。其次，降低罗非鱼的放养密度，在拉网、收捕等操作时避免鱼体受伤，减少应激。Raasheed 等[35]发现，皮肤受损的大底鳉对链球菌污染的水体更敏感。再次，做好苗种消毒。已有研究[36]发现，无乳链球菌可以随着苗种或水体传播。罗非鱼苗种卫生质量对于罗非鱼链球菌病的防控至关重要，对繁殖用的鱼卵、亲鱼，引进的鱼苗等进行严格消毒和病原监测，切断传染源，可减少链球菌感染的概率。最后，坚持“早晚巡塘”“早发现早诊断早治疗”。发现罗非鱼感染链球菌，及时捞出病死鱼并进行无害化处理，可减少疾病传播；隔离发病鱼，消毒养殖水体、用具和周围坏境，防止将致病菌带入健康池塘。

目前，市场上暂无商品化的鱼类无乳链球菌病疫苗，因此对疫苗的开发已经成为国内外研究的重点。张晗[37]通过注射实验用无乳链球菌灭活疫苗可使罗非鱼对无乳链球菌的抵抗力显著提高，说明有望通过疫苗的研究及推广控制罗非鱼无乳链球菌病的传播和暴发。

近年来，罗非鱼链球菌病给世界范围内的罗非鱼养殖业造成巨大的损失，做到切实有效的避免罗非鱼链球菌病的暴发和传播，就要建立完善的监测机制，定期采样送检，发现可疑症状时使用快速准确的方法进行诊断，例如本研究选用B 族链球菌显色培养基，通过比对菌落颜色，可以更快地排查发病病原，有助于及时确诊并采取治疗。此外，应加强链球菌对罗非鱼的侵染机制研究，促进疫苗的研制和应用，更好地为防治罗非鱼链球菌病提供依据。因此，加强鱼源无乳链球菌流行病学监测和防控，对罗非鱼养殖业健康发展和兽医公共卫生具有重要意义。