强直性脊柱炎患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的变化及临床意义

陈溶微 谢文静 江裕 马国斌

【摘要】 目的 探讨强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis， AS）患者外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（Treg）的变化及临床意义，为其临床诊治提供参考。

方法 选择福州市第二医院风湿免疫科及骨科在2018年10月至2021年3月收治的80例AS患者作为研究对象，根据Bath AS疾病活动指数评分（BASDAI）不同将患者分为非活动组（n=50，BASDAI<4）和活动组（n=30，BASDAI≥4）两组，另取同期体检的50名健康者作为对照组。比较各组受试者相关血清学指标变化，观察各组外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg、CD8+CD28+Tc、CD8+CD28-Treg及CD8+CD28+/CD8+CD28-值差异，采用Pearson法对CD4+CD25+Foxp3+Treg、CD8+CD28+ Tc、CD8+CD28-Treg及CD8+CD28+/CD8+CD28-与BASDAI、血沉（ESR）、超敏C反应蛋白（hs-CRP）的相关性进行分析。

结果 活动组的BASDAI分级评分高于非活动组，活动组和非活动组的血清hs-CRP、ESR水平均明显高于对照组，且活动组高于非活动组，差异有统计学意义（P<0.05）。活动组和非活动组的外周血CD8+CD28+/CD8+CD28-、CD8+CD28+Tc细胞值及血清IL-17A、IFN-γ、TNF-α、IL-6水平均明显高于对照组，外周血CD8+CD28-Treg、CD4+CD25+Foxp3+Treg均明显低于对照组，且活动组上述指标变化更为显著（P<0.05）。经Pearson相关性分析显示，CD4+CD25+Foxp3+Treg与BASDAI分级、ESR及hs-CRP均呈负相关（P<0.001），CD8+CD28+Tc及CD8+CD28+/CD8+CD28-值与BASDAI分级均呈正相关（P<0.05）。

结论 外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞表达异常，在疾病发生发展过程中作用显著，且与AS疾病BASDAI评分呈负相关，具有一定的临床参考价值。

【关键词】 强直性脊柱炎;活动度;CD4+CD25+Foxp3+;調节性T细胞

中图分类号：R593.23   文献标志码：A   DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2022.04.007

Changes and clinical significance of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells in peripheral blood of patients with ankylosing spondylitis

CHEN Rongweia， XIE Wenjinga， JIANG Yua， MA Guobinb▲

（a. Department of Laboratory Medicine， b. Department of Cardiology， The Second Hospital of Fuzhou City， Fuzhou 350007， Fujian， China）

【Abstract】 Objective To investigate the changes and clinical significance of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells （Treg） in peripheral blood of patients with ankylosing spondylitis （AS）， so as to provide references for clinical diagnosis and treatment.

Methods 80 AS patients admitted to the Department of Rheumatology and Immunology and Orthopedics of The Second Hospital of Fuzhou City from October 2018 to March 2021 were selected as research objects. According to the Bath AS disease activity index score （BASDAI）， patients were divided into inactive group （n=50， BASDAI<4） and active group （n=30， BASDAI≥4）. In addition， 50 healthy people who received physical examination during the same period were selected as control group. The changes of relevant serum indexes of subjects in each group were compared， and the differences of CD4+CD25+Foxp3+Treg， CD8+CD28+Tc， CD8+CD28-Treg and CD8+CD28+/CD8+CD28- values in peripheral blood of each group were observed. In addition， Pearson method was used to analyze the correlation between CD4+CD25+Foxp3+Treg， CD8+CD28+Tc， CD8+CD28-Treg， CD8+CD28+/CD8+CD28- and BASDAI， erythrocyte sedimentation rate（ESR）， and hypersensitive C-reactive protein（hs-CRP）.

Results The BASDAI grading score of the active group was significantly higher than that of the inactive group， the levels of serum hs-CRP and ESR in the active group and the inactive group were significantly higher than those in the control group， and those of the active group were higher than those in the inactive group， and difference was statistically significant （P<0.05）. The CD8+CD28+/CD8+CD28- and CD8+CD28+Tc cell values in peripheral blood and serum IL-17A， IFN-γ， TNF-α， IL-6 levels of the active group and the inactive group were significantly higher than those of the control group， while the  CD8+CD28-Treg and CD4+CD25+Foxp3+Treg in peripheral blood were significantly lower than those in the control group， and the changes in the above indicators in the active group were more significant（P<0.05）. Pearson correlation analysis showed that CD4+CD25+Foxp3+Treg was negatively correlated with BASDAI grading， ESR and hs-CRP（P<0.001）， CD8+CD28+Tc and CD8+CD28+/CD8+CD28-values were positively correlated with BASDAI grading（P<0.05）.

Conclusion The abnormal expression of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells in peripheral blood plays a significant role in the development of the disease， and it is negatively correlated with the BASDAI score of AS disease， which has certain clinical reference value.

【Key words】 AS; mobility; CD4+CD25+Foxp3+; regulatory T cells

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis， AS）是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，临床主要特征为关节强直，椎间盘纤维环及其附近的结缔组织骨化、纤维化，脊柱和骶髂关节附着点炎症[1]。在我国AS的患病率为0.3%左右，且病程相对较长，多以男性为主，具有较高的致残率[2]。目前关于AS的发病机制及病因尚未有权威性说明，相关研究显示，AS的发生发展与淋巴细胞亚群功能异常、比例失衡、细胞免疫调节功能紊乱以及T细胞异常激活关系较为密切[3]。而调节性T细胞（Treg）是一类CD4+T细胞亚群，具有一定的免疫负调节功能，可通过抑制细胞间接触或分泌抑制性细胞因子等途径，对炎症细胞因子分泌、活化以及效应T细胞增殖进行抑制，从而达到对自身免疫耐受进行维持，发挥抗炎的效果[4]。CD4+CD25+调节性T细胞是一种在胸腺合成、分化及成熟的具有免疫功能的细胞亚群[5]。多项研究结果显示，多种自身免疫性疾病存在Treg功能和数量上的平衡失调[6～7]。但不同表型的Treg细胞在AS体内的表达异常情况，以及与病情活动度的关系尚未解释清楚。故本文探讨AS患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg的变化及临床意义，为其临床诊治提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择我院风湿免疫科及骨科在2018年10月至2021年3月收治的80例AS患者作为研究对象，根据Bath AS疾病活动指数评分（BASDAI）不同将患者分为非活动组（n=50，BASDAI<4）和活动组（n=30，BASDAI≥4）两组。其中非活动组患者男43例，女7例，年龄18～50岁，平均（30.76±4.09）岁，病程0.2～30年，平均（6.57±4.18）年;活动组患者男27例，女3例，年龄16～50岁，平均（30.40±5.09）岁，病程0.3～30年，平均（6.76±5.10）年。另取同期在我院体检的50名健康者作为对照组，其中男41人，女9人，年龄19～48岁，平均（29.32±4.47）岁。各组受试者在年龄、性别等一般资料方面差异无统计学意义，具有可比性（P>0.05）。

1.2 纳入和排除标准

纳入标准：①符合1984年美国风湿病协会修订的关于AS诊断标准[8];②疾病活动度符合2009年国际脊柱关节炎协会（ASAS）制定新AS病情活动度评分中的相关规定[9];③经本院伦理学委员会批准实施（180612）;④所有受试者均签署知情协议书。排除标准：①合并炎症疾病、自身免疫性疾病及风湿病者;②合并严重的心肝肾功能障碍者;③妊娠哺乳期者;④近期经过糖皮质激素及其他免疫抑制剂治疗者;⑤肿瘤、感染引发的关节疼痛者;⑥合并高热、肺部或肝胆道感染、严重的上呼吸道感染及败血症者;⑦合并周围血管栓塞性疾病或者周围血管疾病者;⑧依从性差，中途退出者。

1.3 方法

1.3.1 儀器与试剂

流式细胞仪为BD公司生产的FACScaibur型号;低速离心机购于上海手术器械厂;微型旋涡混合器购于上海跃进医疗器械厂的WXH型号。FACSTM Lysing solution红细胞裂解液、磷酸缓冲液（PBS）、HLA-B27试剂盒、PE-CY7-鼠抗人CD3抗体、APC-鼠抗人CD25、PE-鼠抗人CD28、PE-鼠抗人CD127、FITC-鼠抗人CD4、FITC-鼠抗人CD8及Foxp3试剂盒均购于美国BD公司。

1.3.2 外周血Treg水平检测

取所有受试者清晨8～9点的2 mL空腹静脉全血，抗凝采用EDTA-K2处理。取4支流式检测管，将上述处理好的50 μL抗凝静脉全血置于其中，并编号1、2、3、4，之后分别向检测管1和3中加入APC-鼠抗人CD25、PE-鼠抗人CD127、FITC-鼠抗人CD4以及与此相对应的同型抗体，之后再在检测管2和4中加入PE-CY7-鼠抗人CD3抗体、PE-鼠抗人CD28、FITC-鼠抗人CD8以及与此相对应的同型对照抗体，每种抗体的用量5 μL，涡旋对上述检测管进行混匀处理，之后在室温条件下，进行30 min的避光孵育，再将2 mL的10红细胞裂解液加入其中，混匀后在避光室温条件下进行10 min的孵育，直到红细胞全部溶解以后，再将3 mL的PBS加入其中，3000 rpm条件下进行5 min的离心，弃去上清液，重复上述操作1次，再将PBS重悬细胞500 μL加入其中，之后通过流式细胞仪对其进行监测。通过侧向散射角和前向散射角对门圈进行设置，将淋巴细胞取出，再分别利用CD8和侧向散射角、CD4和侧向散射角对门圈进行设置，将CD8+和CD4+淋巴细胞取出，对CD8+淋巴细胞上的CD28和CD4+淋巴细胞上的CD127、CD25表达情况进行测定，并计算CD8+CD28-Treg占总淋巴细胞比例、CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+淋巴细胞比例。每次获取设门内细胞10 000个以上，Flowjo和Diva软件对上述数据进行分析整理，Foxp3的检验严格按照试剂盒操作说明书执行。

1.3.3 相关临床指标测定

采集5 mL的外周静脉血，将其置于干燥管中，之后3000 rpm条件下离心10 min，取上清液，-80℃条件下保存待用。血清超敏C反应蛋白（hs-CRP）采用散射免疫比浊法进行检测，血清血沉（ESR）采用魏氏法进行测定。

1.3.4 血清炎症因子水平

采用酶联免疫吸附法对血清白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、γ干扰素（IFN-γ）、白细胞介素17A（IL-17A）进行测定，试剂盒购于上海钰博生物科技有限公司，操作方法严格按照说明书执行。

1.4 统计学方法

应用SPSS 22.0进行数据分析，服从正态分布的计量资料描述为（±s），多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用q检验;计数资料比较行χ2检验;采用Pearson法对相关性进行分析。检验水准：α=0.05，双侧检验。

2 结  果

2.1 各组受试者相关临床指标变化

活动组的BASDAI分级评分高于非活动组，活动组和非活动组的血清hs-CRP、ESR水平均明显高于对照组，且活动组高于非活动组，差异有统计学意义（P<0.001）。见表1。

2.2 各组受试者血清炎症因子水平变化

活动组和非活动组的血清IL-17A、TNF-α及IL-6水平均明显高于对照组，且活动组上述血清炎症因子升高更为显著（P<0.05）;而活动组IFN-γ水平高于对照组，非活动组IL-2则高于对照组（P<0.05）。见表2。

2.3 各组受试者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg、CD8+CD28+Tc、CD8+CD28-Treg及CD8+CD28+/CD8+CD28-值变化

活动组和非活动组的外周血CD8+CD28+/CD8+CD28-、CD8+CD28+Tc细胞值均明显高于对照组，CD8+CD28-Treg、CD4+CD25+Foxp3+Treg均明显降低，且除CD8+CD28-Treg外，活动组上述T细胞变化更为显著（P<0.05）。见表3。

2.4 CD4+CD25+Foxp3+Treg、CD8+CD28-Treg与BASDAI、ESR、hs-CRP相关性分析

经Pearson相关性分析显示，CD4+CD25+Foxp3+Treg与BASDAI分级、ESR及hs-CRP均呈负相关（P<0.001）。见表4。

2.5 CD8+CD28+Tc及CD8+CD28+/CD8+CD28-值与BASDAI、ESR、hs-CRP相关性分析

经Pearson相关性分析显示，CD8+CD28+Tc及CD8+CD28+/CD8+CD28-值与BASDAI分级均呈正相关（P<0.05）。见表5。

3 讨  论

AS是以骶髂关节、中轴脊柱受累为主的一种炎症性和慢性自身免疫性疾病，伴有不同程度的外周关节症状，严重者可致使关节强直和脊柱畸形[10]。目前对于其发病机制和病因尚未有权威性说明，但机体免疫功能异常，尤其是T细胞免疫功能异常对AS的发病作用显著[11]。Treg是一类T细胞亚群，可对体内自身免疫反应进行控制，按照来源的不同可将其分为诱导产生的适应性调节性T细胞和自然调节性T细胞，按照免疫表型的不同，可将其分为NKT、CD4+CD25+、CD4+CD25+Foxp3+、CD8+CD28-细胞[12]。其中CD4+CD25+Treg的功能和数量异常是人类出现炎性疾病或者自身免疫性疾病的重要因素。多项研究也表明多种疾病的发生发展与不同表型Treg的异常表达关系密切[13～14]。HAN等[15]研究显示，与健康者相比，AS患者外周血CD8+CD28-Treg水平明显升高，CD4+CD25+Treg水平明显降低。也有研究显示[16]，与正常组相比，多发性硬化症患者外周血CD4+CD25+Foxp3+细胞水平明显降低。但目前临床上对于不同表型Treg，尤其是CD4+CD25+Foxp3+细胞与AS患者之间关系的研究报道相对较少。

本研究结果显示，与對照组相比，活动期的AS患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg水平均明显降低。且相关性分析显示，外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg水平与BASDAI、ESR、hs-CRP均呈负相关，与以往研究结果相符合[17]。表明CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞水平可以较好地反映AS患者病情严重程度及病情活动度。另外，关于CD8+CD28-Treg相关结果表明，在AS患者中，CD8+CD28-Treg的占比相对较低，对CD8+CD28+Tc细胞的抑制作用也会相对降低，致使CD8+CD28+Tc细胞出现相应的增殖和活化，这两种细胞之间的平衡被打破可能在AS的发生发展过程中起着关键性的作用。这可能是由于CD28分子可与CD86或者CD80相结合，形成活化T细胞所必须的一种信号因子，根据细胞膜对CD28分子的表达情况，可以将其分为CD8+CD28-Treg和CD8+CD28+Tc（杀伤性）细胞。其中CD8+CD28+Tc可特异性识别体内的抗原，执行相应的免疫功能，而CD8+CD28-Treg可通过下调和上调共刺激分子和APCs表面的抑制性受体的表达，从而达到降低T细胞活化，抑制免疫功能的效果[18]。在不同细胞因子的作用下，初始CD4+T细胞可以分化成Th17、Th2、Th1细胞，其中Th17细胞可分泌IL-17等细胞因子;Th2细胞分泌IL-6等因子，可对体液免疫反应产生介导作用，从而促进细胞活化;Th1细胞可分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等炎症因子，对细胞炎症反应及细胞免疫反应产生介导效果。文中关于血清炎症因子水平的结果表明，Treg细胞数量的减少会相应降低其自身免疫抑制作用，增强Th细胞的功能性，致使自身免疫淋巴细胞过度增殖，从而产生大量的自身抗体和炎症因子，机体免疫功能失调，进而致使自身免疫反应的发生。

综上所述，外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞表达异常，在疾病发生发展过程中作用显著，且与AS的BASDAI评分呈负相关，具有一定的临床参考价值。

参 考 文 献

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（收稿日期：2022-02-11 修回日期：2022-03-29）

（编辑：潘明志）