基于网药学方法探究透脓散治疗慢性骨髓炎的分子作用机制

郭光鑫　孙颖　栾海鹏　管东辉

摘要 目的：使用中药复方网络药理学技术探讨透脓散治疗慢性骨髓炎的潜在作用机制。方法：通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库搜索透脓散中黄芪、当归、川芎、皂角刺中所含有的化合物（因目前国家对于穿山甲稀有动物的保护，为响应国家号召，未进行穿山甲化合物的采集），筛选出透脓散中药物的符合要求的活性成分及作用靶点;通过人类基因数据库（GeneCards）搜索慢性骨髓炎的靶点信息;使用Cytoscape分析软件进行“药物-化合物-靶点”分析，导入功能蛋白联系网络数据库（STRING）行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的分析，之后使用DAVID数据库进行Gene ID转换，差异基因的功能、通路富集分析等。結果：筛选后共获得透脓散治疗慢性骨髓炎的431个相关成分和227个靶点信息;慢性骨髓炎的相关靶点信息438个;PPI网络46个核心蛋白，关键涉及白细胞介素-10、白细胞介素-6、MMP9、TP53等;获得GO生物过程368条，主要涉及细胞增殖、免疫、炎症反应、细胞凋亡;KEGG信号通路88条，涉及破骨细胞分化、疟疾、甲型流感、类风湿性关节炎、核因子κB以及TNF信号通路。结论：透脓散可能通过控制细胞凋亡、免疫炎症反应等途径对慢性骨髓炎发挥治疗作用，通过分析为透脓散治疗慢性骨髓炎提供微观层面的理论信息支持。

关键词 透脓散;网络药理学;慢性骨髓炎;信号通路;作用机制

Exploration of Molecular Action Mechanism of Tounong Powder in the Treatment

of Chronic Osteomyelitis Based on Pharmacy Network

GUO Guangxin，SUN Ying，LUAN Haipeng，GUAN Donghui

（1 The First Clinical Medical College of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China; 2 School of

Traditional Chinese Medicine，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China; 3 Affiliated Hospital

of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Ji′nan 250014，China）

Abstract Objective：To explore the potential action mechanism of Touyu Powder in the treatment of chronic osteomyelitis by using Chinese herbal compound network pharmacology technology.Methods：Through the database of the Laboratory of Computational Systems Biology（TCMSP），we searched for compounds contained in Astragalus，Angelica，Ligusticum chuanxiong and Saponaria japonicus in Toupu Powder（Due to the current national protection of rare pangolin animals，in response to the call of the country，no collection of pangolin compounds has been carried out）.We screened out the active ingredients and target of action of the drugs in Touyu Powder; we searched for the target information of chronic osteomyelitis through the human gene database（GeneCards）; used Cytoscape analysis software to perform “drug-compound-target” analysis，imported the functional protein connection network database（STRING） to analyze the protein interaction network，and then used the DAVID database for Gene ID conversion，differential gene function，pathway enrichment analysis，etc.Results：After screening，a total of 431 related components and 227 target information for the treatment of chronic osteomyelitis by Touyu Powder were obtained; related target information for chronic osteomyelitis was 438; there were 46 core proteins of protein interaction network.The key was related to interleukin 10，interleukin 6，and interleukin 6 MMP9，TP53，etc.; we obtained 368 GO biological processes，mainly related to cell proliferation，immunity，inflammation，apoptosis; there were 88 KEGG signaling pathways，related to osteoclast differentiation，malaria，influenza A，rheumatoid arthritis，NF-kB and TNF signaling pathway.Conclusion：Touyu Powder may have a therapeutic effect on chronic osteomyelitis by controlling cell apoptosis and immune inflammatory response.The analysis of this paper provides microscopic theoretical information support for the treatment of chronic osteomyelitis with Touyu Powder.

Keywords Touyu Powder; Network pharmacology; Chronic osteomyelitis; Signaling pathway; Mechanism action

中图分类号：R289.5;R274.9文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.06.004

慢性骨髓炎是一种骨的慢性感染性疾病，多见于骨折手术之后、糖尿病控制不佳的严重并发症、血源性骨感染等。其可见反复发作病史、非特异性疼痛、皮肤色素沉着、颜色异常、健侧患侧不对称性肿胀，有的甚至可能会出现窦道[1]。临床上的慢性骨髓炎并不少见，尽管随着外科手术技术的进步以及抗生素治疗水平的逐渐提高，骨髓炎的治疗较之前有很大提高，但是随着临床上抗生素的大量使用，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌等一些耐药菌，依然是令骨科医生头疼的问题。目前的骨髓炎的手术治疗多采用的是感染骨段切除加骨搬运以及各种带万古霉素植入术，且一般需长期使用抗生素，对于肝肾损害很大，会出现耳毒症、消化道反应、免疫变态反应、“红人综合征”以及血液成分异常等不良反应[2]。慢性骨髓炎在中医学中称为“附骨疽”，多由于患者在感受疔疮疖痈等毒、麻疹、伤寒等疾之后，余毒未清，伏结于内，久而入骨成疽;或因外伤，血瘀气滞，积瘀成疽，聚毒而为病[3]。最初记载于《诸病源候论》：“附骨痈……与热气相搏，伏结近骨成疽……谓之附骨痈也。”

透脓散，始出《外科正宗》，记载可治痈疮诸毒，内脓不透之病。方由当归、穿山甲、皂角刺、黄芪、川芎等五味药组成。生黄芪补气升阳、托毒排脓，为疮家之圣药;当归补血和血，祛体内之积血;川芎补血活血，养新血破积血，行血中之气，二者常合用来养血合营。皂角刺可托毒排脓、引药上行，助黄芪透散之力，直达病所，消脉络之积，祛陈腐之气。全方合用共奏补虚脱毒、溃疮透脓之效。目前临床上常用透脓散治疗慢性骨髓炎，在长期的临床实践中效果显著[4-5]。本研究运用中药复方网络药理学的方法筛选透脓散中部分药物的活性化合物及其作用靶点，形成“药物-化合物-靶点”，并预测信号通路，分析透脓散治疗慢性骨髓炎的相关分子机制。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分筛选 借助中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），分别以“黄芪”“当归”“皂角刺”“川芎”检索透脓散中部分中药活性化合物成分，其中因穿山甲为国家保护动物，且2020年《中华人民共和国药典》也将穿山甲移除，为遵守国家相关动物保护条例，防止出现因药物特殊疗效引起的穿山甲捕杀情况，未对其进行检索分析。根据药物的吸收、分布、代谢和排泄原则，口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）越高，类药性（Drug Likeness，DL）越高。结合以往文献选取OB≥30%、DL≥0.18为标准[6]，筛选出黄芪、当归、皂角刺、川芎的活性化合物中符合标准的成分进行分析。

1.2 药物作用疾病靶点筛选 通过TCMSP检索筛选得到的活性化合物成分，查找靶点蛋白，运用Uniprot蛋白质数据库查询所有靶点蛋白所对应的genename，并合并重复值，删除无对应genename的靶点蛋白。运用Cytoscape 3.7.2分析并构建“药物-化合物-靶点”。

1.3 靶点间相互作用分析 在疾病靶点数据库中检索“Chronic osteomyelitis”相关疾病基因[7]。将之前得到的药物靶点和疾病靶点进行映射，所得的交集部分作为透脓散治疗慢性骨髓炎的潜在治疗靶点。将上述得到的潜在靶点从STRING数据库[8]以“Homo Sapiens”为界定进行分析，得到蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）关系，并应用Cytoscape分析得到核心作用靶点。

1.4 作用机制图绘制及预测 分析筛选出来的潜在作用靶点基因、信号通路，应用DAVID数据库，以P<0.05，物种“Homo Sapiens”，进行基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路分析[9]。GO富集分析选用Biological process、Molecular function、Cellular components按照其靶点数目进行排序，选取富集的前20条，并绘制气泡图，通过Omicshare云平台绘制KEGG通路富集。

2 结果

2.1 药物活性成分 根据OB≥30%、DL≥0.1得到透脓散中化合物共431个，包括异黄酮、福莫宁等。表1为透脓散部分活性化合物。

2.2 药物作用靶点 运用Cytoscape 3.7.2软件构建图1的透脓散中“药物-活性化合物-靶点”网络。

2.3 透脓散治疗慢性骨髓炎的潜在作用靶点的预测 通过GeneCards数据库检索到438个慢性骨髓炎的潜在靶点。制作交叉验证靶标韦恩图，共得到46个交集靶点，将这46个靶点视为“透脓散”治疗慢性骨髓炎的预测靶点。见图2。

2.4 靶PPI网络分析 将透脓散治疗慢性骨髓炎的46个交集靶点输入STRING数据库分析，利用Cytoscape 3.7.2软件进行靶PPI网络分析，靶点Degree值越大，形状越大，颜色越深，平均节点度值为26.09，其中度值大于24的靶蛋白有32个，表明这几个靶点在韦恩网络中起了关键作用，可以作为透脓散治疗慢性骨髓炎的重要预测靶点。见图3。筛选出网络中排名前10的关键节点，关键节点网络见图4，详细信息见表3。

2.5 GO功能富集分析及KEGG信号通路富集分析 将46个潜在靶点提交DAVID数据库中，按照P<0.05进行筛选，选取富集基因前20进行分析，其中涉及368个生物过程（Biological Process，BP）（图5）、43种分子功能（Molecular Function，MF）（图6）和22类细胞组分（Cellular Component，CC）（图7）。主要涉及细胞增殖、免疫、炎症反应、细胞凋亡、毒性反应、蛋白质结合、细胞因子活性、相同的蛋白结合、蛋白均二聚活性、蛋白异二聚体活性、细胞外空间、细胞质、胶质溶胶、细胞外泌体、线粒体基因等。

将46个潜在靶点提交DAVID数据库中，按照P<0.05筛选，进行KEGG通路富集分析，涉及88条信号通路，主要涉及类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）、破骨细胞分化、疟疾、甲型流感、核因子κB信号通路、TNF信号通路等。绘制排名前20的气泡图。见图8。根据蛋白质与信号通路之间的关系，选取关键靶点，借助Cytoscape 3.7.2软件，绘制“靶点-通路”图。见图9。绿色菱形为通路，红色圆形为靶点。

3 讨论

慢性骨髓炎是骨科临床上并不少见的慢性骨感染性疾病，无明显年龄发病特点，任何行骨折手术治疗的患者都有可能发生，多为急性骨髓炎的延续，易复发。其治疗失败可能导致骨折内固定失败、死骨和窦道形成、长期排脓、甚至恶变等严重后果，影响

患者的身体健康、生命质量，对患者造成巨大的精神负担和经济负担[10]。目前常用的治疗方式多为高级抗生素配合下的手术治疗[11-14]，但手术的缺点是次数多、创伤大、患者的心理压力较大，并且一般会出现抗生素的不良反应。有临床治疗经验及临床观察表明，透脓散可以有效消除局部病灶症状，改善身体整体状况，加速愈合，并有效预防复发[4-5，15]。

本研究结果表明，透脓散中包含431个化合物，40个活性成分，227个作用靶点，透脓散治疗慢性骨髓炎的潜在作用靶点195个，筛选得到46个关键化合物，根据中心度值及等级值，从高到低依次是槲皮素、山柰酚、谷甾醇、豆甾醇、fisetin，其中槲皮素的度值最高为285。槲皮素可以抗炎症反应、抗病毒、抗肿瘤、降低血糖及免疫调节等作用[16]。Britti等[17]发现槲皮素联合棕榈酰乙醇酰胺可以大大改善大鼠关节炎模型的活动度、疼痛指数、组织学评分，还可通过降低TNF-α、IL-1β、IL-6等的表达发挥治疗关节炎的作用。李阳等[18]发现，槲皮素对肝脏氧化损伤有保护作用。山柰酚具有抗癌细胞、治疗糖尿病、保护损伤细胞等功能，并且可以调节Ca代谢，促进胶原产生，减少骨小梁丢失间接治疗骨质疏松，因此山柰酚对于慢性骨髓炎造成的骨丢失可能会有一定的帮助作用[19-20]。谷甾醇、豆甾醇是常见植物甾醇，具有抵抗炎症、参与免疫调节。Chen等[21]在大鼠OA模型中发现豆甾醇能够降低软骨降解，并显著抑制基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinase，MMP）的表达，可能被认为是一种治疗关节炎的可行药物;并且豆甾醇还具有抗氧化、抗肿瘤、镇痛以及治疗糖尿病的作用[22]。fisetin可以影响细胞内血红素加氧酶（Heme Oxygenase，HO）-1的表达，清除细胞内活性氧，通过减少氧化损伤，从而对于细胞起到一定的保护作用，对于慢性病有一定的预防作用[23]。

透脓散在治疗慢性骨髓炎的PPI网络结果分析中，其中46个核心靶点蛋白中IL-6、AKT1、VEGFA、MMP9、TP53等靶点是透脓散治疗慢性骨髓炎的主要作用靶点。IL6是主要的炎症介质，也是骨性关节炎等发病的重要介质，参与炎症反应的调节[24]。蛋白激酶（AKT1）同样也是参与炎症反应的物质之一，有研究表明，上调OA模型大鼠的微小RNA-543，可以促进软骨细胞增殖，拮抗IL-1β诱导的软骨细胞损伤，下调鼠双微体（Mouse Double Minute4，MDM4）表达、上调AKT1、Bcl-2等的表达，减少炎症介质的产生，并且AKT1对于对抗软骨细胞的损伤也有一定的作用[25-26]。血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）具有抗成骨细胞凋亡，维系成骨细胞的成活促进局部成骨的作用[27]。另外，VEGF的表达还与滑膜炎症、软骨变性及软骨细胞凋亡等密切相关[28]。MMP是具有降解几乎所有细胞外基質功能的酶，存在于正常人体内，参与伤口愈合、软骨基质降解、骨吸收过程，该物质的减少也可以减少炎症介质的释放，调整异常的基质降解和血管形成等，从而起到炎症缓解、减少软骨和骨质破坏[29]。肿瘤蛋白P53则参与癌症细胞凋亡，参与抑癌细胞的侵袭迁移及细胞凋亡过程[30]。

GO富集分析主要涉及细胞增殖、免疫、炎症反应、细胞凋亡等。KEGG主要涉及类风湿关节炎、疟疾、甲型流感、破骨细胞分化、核因子κB信号通路、TNF信号通路。而进一步分析可以看出，核因子κB信号通路、TNF信号通路均涉及到类风湿性关节炎、破骨细胞分化，二者通过相互作用，抑制炎症介质的释放和成骨细胞的分化[31-32]，并且TNF信号通路还可以介导炎症介质TNF-α，抑制滋养细胞的增殖和侵袭，促进细胞凋亡。核因子κB通过对多种基因表达的调节，影响机体免疫反应，从而在机体免疫功能调节中发挥重要作用。由此分析可以得出，核因子κB信号通路、TNF信号通路可以通过抑制炎症介质释放以及免疫调节作用达到炎症缓解的作用，增加机体免疫力等，以达到缓解或治疗慢性骨髓炎的效果。

综上所述，通过分析预测，该中药复方可能通过细胞增殖、凋亡、免疫炎症反应等方面发挥治疗作用，通过该分析，可以将透脓散作为治疗慢性骨髓炎的一种长期服用药物，大大降低了长期应用抗生素对于机体的不良影响。但是本研究有一定局限性，对于中药的反应因人而异、要严格辨证论治，另外因数据库数据不全或者筛选原因以及某些珍贵稀有药物的原因，造成了某些中药未进行检索等。因此详细的治疗机制和临床疗效仍需要临床去验证。

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（2020-07-28收稿 本文编辑：张雄杰）

基金项目：山东省中医药科技发展计划项目（2019-0144）

作者简介：郭光鑫（1995.08—），男，硕士研究生在读，研究方向：中醫骨伤科学，E-mail：962246009@qq.com

通信作者：管东辉（1974.07—），男，博士，副主任医师，研究方向：中医骨伤科学，E-mail：guanyisheng0720@163.com